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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Triton X-114法提取膜蛋白
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小墨825: 金币+5, ★有帮助 2013-09-27 15:31:20
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小墨825 at 2013-09-19 16:44:09
哎呀，您太谦虚啦！我就是利用Triton X-114的方法分层的，非离子表面活性剂Triton X-114溶液在0 ℃下分布均匀，但高于20 ℃时分为水相和去污相（含膜蛋白）。在初始溶液中加入1%的Triton X-114，进行多次分层，收集 ...

根据你给的信息，你油状粘稠的部分，加入缓冲液之后，降低温度，应该会再次溶解，因为你初始溶液中加入1%的Triton X-114是可以溶的，分层之后的 X-114应该也是可以再次溶解的。粘稠的X-114层溶解之后用超滤的方法将蛋白质浓缩，再用浓缩管将里面的溶液换成含有1% triton X-100的溶液，就可以过其他柱子（疏水柱除外）。不知能否帮你。
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11楼2013-09-23 18:59:07
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ynkuaile

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小墨825 at 2013-09-19 16:44:09
哎呀，您太谦虚啦！我就是利用Triton X-114的方法分层的，非离子表面活性剂Triton X-114溶液在0 ℃下分布均匀，但高于20 ℃时分为水相和去污相（含膜蛋白）。在初始溶液中加入1%的Triton X-114，进行多次分层，收集 ...

我想TRITON X-114层再溶解的时候，最好TRITON X-114的浓度还为1%或更低。不知你稀释的倍数是多少，因为大量稀释后，表面活性剂在水溶液中会形成胶束，胶束的粒径可能比你透析或超滤的孔径都大，如果浓度高，那么表面活性剂是透不过去的，超滤也除不掉。我想，分层提取之后，用缓冲液溶解回原来的体积甚至更大，然后超滤浓缩其中的蛋白，然后换成1 % TRITON X-100的溶液。以上是个人想法，仅供参考。我没有做过分层萃取蛋白的实验，我还是有很多问题想你能解答我的。
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12楼2013-09-23 19:12:33
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如PEG200；多元醇类表面活性剂，如 山梨醇、司 盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。   也可以用天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆 酸类、多糖类（如环糊精）等。具体用法可以参考有关试剂使用说明。浓度尽量低一些为好，浓度不能超过临界胶束浓度（Citical Micelle Concentration ，简称：CMC）。  临界胶束浓度cmc的含义如下：在水中的表面活性剂低浓度时呈分子状态，并且三三两两地把亲油基团靠拢而分散在水中，当浓度逐渐增大一定程度时，许多表面活性剂分子立刻结合成大基团，形成“胶束”表面活性剂在水中形胶束所需的最低浓度称为临街胶束浓度，即CMC.意义：CMC可作为表面活性剂表面活性的一种度量，CMC越小，表明这种活性剂形成胶束所需的浓度越低，达到表面饱和吸附的浓度越低。因而改变表面性质从 而起到润湿，乳化，增溶，起泡等作用所需的浓度也越低。此外，临界胶束浓度也是表面活性剂溶液性质发生显著变化的一个分水岭，CMC值对表面活性剂的研究 有着及其重要的参考价值的数据。   临界胶束浓度测定方法很多，用不同方法验证即可（1）表面张力法http://www.anatrace.com/tech_tips/TechBul_105.pdf（2）电导率法 方法＆原理http://151.fosu.edu.cn/hxsy/wuli ... daofajiaosu%20z.htmhttp://u.edu.cn/UpLoadFile/20080119080151.doc （3）紫外吸收分光光谱http://www.ilib.cn/A-hxxb200624009.html（4）.芘荧光探针光谱法http://www.ilib.cn/A-shjsyyy200701012.html其中芘荧光探针光谱法可信度较高 （5）Citical Micelle Concentration by Conductance and Ramanhttp://ed.augie.edu/~awaspaas/pchem/labs/cmc/cmc.html（4）也可以采用高浓度的（到3mol/L）的离子解离盐（比如KCN或KI）或中低浓度的变性剂（低于4mol/L）的尿素或盐酸胍，都是分梯度加入。
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13楼2013-09-24 12:11:20
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小墨825: 金币+5, ★有帮助 2013-09-27 15:31:35
如果表面活性剂在稀溶液中形成了胶束，用透析可能失效，要看具体的胶束的大小，不能一概而论。同样在稀溶液中膜蛋白也会形成沉淀，但是两者的颗粒大小肯定不同，所以可以考虑使用超速离心分离两者。

分离后的膜蛋白任然可以用非离子表面活性剂复溶，这样可以去除很多的杂质！如果表面活性剂在稀溶液中形成了胶束，用透析可能失效，要看具体的胶束的大小，不能一概而论-------这是具体的定量化问题，不是家男的非黑即白的问题！！
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14楼2013-09-24 12:16:59
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小墨825

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-09-23 19:12:33
我想TRITON X-114层再溶解的时候，最好TRITON X-114的浓度还为1%或更低。不知你稀释的倍数是多少，因为大量稀释后，表面活性剂在水溶液中会形成胶束，胶束的粒径可能比你透析或超滤的孔径都大，如果浓度高，那么表 ...

你的想法跟老师提的一样。初始溶液中加入1%的Triton X-114分为上层1和下层1，上层1继续加入1%的Triton X-114，再次分层，得到上层2和下层2，上层2重复上述步骤，得到下层3，合并下层1、2、3使用PBS进行分层，重复2次，得到最终的样品。所以我最终的样品Triton X-114的浓度稀释至原体积之后绝对超过1%了，我拿出一部分来做实验，随着浓缩的进行，溶液越来越黏稠，还是透不过超滤膜，可能稀释倍数还是不够大，浓度超过了cmc，大量稀释再浓缩很浪费时间啊！
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15楼2013-09-27 15:19:51
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小墨825

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-24 12:16:59
如果表面活性剂在稀溶液中形成了胶束，用透析可能失效，要看具体的胶束的大小，不能一概而论。同样在稀溶液中膜蛋白也会形成沉淀，但是两者的颗粒大小肯定不同，所以可以考虑使用超速离心分离两者。

分离后的膜蛋 ...

在稀溶液中膜蛋白也会形成沉淀，但是两者的颗粒大小肯定不同，所以可以考虑使用超速离心分离两者。——请问这一步的离心机转速要达到多少？就是因为实验室没有超速离心机所以才整得特别麻烦啊！
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16楼2013-09-27 15:21:50
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zhzecai

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 小墨825 at 2013-09-27 15:19:51
你的想法跟老师提的一样。初始溶液中加入1%的Triton X-114分为上层1和下层1，上层1继续加入1%的Triton X-114，再次分层，得到上层2和下层2，上层2重复上述步骤，得到下层3，合并下层1、2、3使用PBS进行分层，重复2 ...

您好，我有几个问题想请教您一下，外膜蛋白最终溶解在triton-114中能做直接细胞实验吗？我看有的文献上最终用丙酮进行蛋白质的沉淀，但是我怀疑蛋白质会不会失活啊？还有就算蛋白质沉淀了，那么用哪种溶液能溶解外膜蛋白呢？因为我想用外膜蛋白做细胞实验
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17楼2013-10-19 22:56:35
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小墨825

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by zhzecai at 2013-10-19 22:56:35
您好，我有几个问题想请教您一下，外膜蛋白最终溶解在triton-114中能做直接细胞实验吗？我看有的文献上最终用丙酮进行蛋白质的沉淀，但是我怀疑蛋白质会不会失活啊？还有就算蛋白质沉淀了，那么用哪种溶液能溶解外 ...

我的经验是丙酮沉淀会大幅失活，不知道你的情况怎么样！
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18楼2013-11-27 10:17:06
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hwj110

新虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by zhzecai at 2013-10-19 22:56:35
您好，我有几个问题想请教您一下，外膜蛋白最终溶解在triton-114中能做直接细胞实验吗？我看有的文献上最终用丙酮进行蛋白质的沉淀，但是我怀疑蛋白质会不会失活啊？还有就算蛋白质沉淀了，那么用哪种溶液能溶解外 ...

你好！你用外膜蛋白做实验，最后是怎么解决的啊？是溶解在triton-X114中做的还在重新溶解在其他的溶剂中做的？
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19楼2013-11-29 10:18:14
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