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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小墨825: 金币+5, 有帮助 2013-09-27 15:31:20
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10楼: Originally posted by 小墨825 at 2013-09-19 16:44:09
哎呀,您太谦虚啦!我就是利用Triton X-114的方法分层的,非离子表面活性剂Triton X-114溶液在0 ℃下分布均匀,但高于20 ℃时分为水相和去污相(含膜蛋白)。在初始溶液中加入1%的Triton X-114,进行多次分层,收集 ...

根据你给的信息,你油状粘稠的部分,加入缓冲液之后,降低温度,应该会再次溶解,因为你初始溶液中加入1%的Triton X-114是可以溶的,分层之后的 X-114应该也是可以再次溶解的。粘稠的X-114层溶解之后用超滤的方法将蛋白质浓缩,再用浓缩管将里面的溶液换成含有1% triton X-100的溶液,就可以过其他柱子(疏水柱除外)。不知能否帮你。
11楼2013-09-23 18:59:07
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 小墨825 at 2013-09-19 16:44:09
哎呀,您太谦虚啦!我就是利用Triton X-114的方法分层的,非离子表面活性剂Triton X-114溶液在0 ℃下分布均匀,但高于20 ℃时分为水相和去污相(含膜蛋白)。在初始溶液中加入1%的Triton X-114,进行多次分层,收集 ...

我想TRITON X-114层再溶解的时候,最好TRITON X-114的浓度还为1%或更低。不知你稀释的倍数是多少,因为大量稀释后,表面活性剂在水溶液中会形成胶束,胶束的粒径可能比你透析或超滤的孔径都大,如果浓度高,那么表面活性剂是透不过去的,超滤也除不掉。我想,分层提取之后,用缓冲液溶解回原来的体积甚至更大,然后超滤浓缩其中的蛋白,然后换成1 % TRITON X-100的溶液。以上是个人想法,仅供参考。我没有做过分层萃取蛋白的实验,我还是有很多问题想你能解答我的。
12楼2013-09-23 19:12:33
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

中性去垢剂 又称非离子表面活性剂,对蛋白质的变性作用影响较少,宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类,如PEG200;多元醇类表面活性剂,如 山梨醇、司 盘类和吐温类;聚氧乙烯脂肪醇醚,如苄泽类、平平加类;聚氧乙烯烷基苯酚醚,如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去;也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白,不必先除去去垢剂。   也可以用天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂,包括种类较为广泛,如各种树胶(阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶)、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆 酸类、多糖类(如环糊精)等。具体用法可以参考有关试剂使用说明。浓度尽量低一些为好,浓度不能超过临界胶束浓度(Citical Micelle Concentration ,简称:CMC)。  临界胶束浓度cmc的含义如下:在水中的表面活性剂低浓度时呈分子状态,并且三三两两地把亲油基团靠拢而分散在水中,当浓度逐渐增大一定程度时,许多表面活性剂分子立刻结合成大基团,形成“胶束”表面活性剂在水中形胶束所需的最低浓度称为临街胶束浓度,即CMC.意义:CMC可作为表面活性剂表面活性的一种度量,CMC越小,表明这种活性剂形成胶束所需的浓度越低,达到表面饱和吸附的浓度越低。因而改变表面性质从 而起到润湿,乳化,增溶,起泡等作用所需的浓度也越低。此外,临界胶束浓度也是表面活性剂溶液性质发生显著变化的一个分水岭,CMC值对表面活性剂的研究 有着及其重要的参考价值的数据。   临界胶束浓度测定方法很多,用不同方法验证即可(1)表面张力法http://www.anatrace.com/tech_tips/TechBul_105.pdf(2)电导率法 方法&原理http://151.fosu.edu.cn/hxsy/wuli ... daofajiaosu%20z.htmhttp://u.edu.cn/UpLoadFile/20080119080151.doc (3)紫外吸收分光光谱http://www.ilib.cn/A-hxxb200624009.html(4).芘荧光探针光谱法http://www.ilib.cn/A-shjsyyy200701012.html其中芘荧光探针光谱法可信度较高 (5)Citical Micelle Concentration by Conductance and Ramanhttp://ed.augie.edu/~awaspaas/pchem/labs/cmc/cmc.html(4)也可以采用高浓度的(到3mol/L)的离子解离盐(比如KCN或KI)或中低浓度的变性剂(低于4mol/L)的尿素或盐酸胍,都是分梯度加入。
13楼2013-09-24 12:11:20
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小墨825: 金币+5, 有帮助 2013-09-27 15:31:35
如果表面活性剂在稀溶液中形成了胶束,用透析可能失效,要看具体的胶束的大小,不能一概而论。同样在稀溶液中膜蛋白也会形成沉淀,但是两者的颗粒大小肯定不同,所以可以考虑使用超速离心分离两者。

分离后的膜蛋白任然可以用非离子表面活性剂复溶,这样可以去除很多的杂质!如果表面活性剂在稀溶液中形成了胶束,用透析可能失效,要看具体的胶束的大小,不能一概而论-------这是具体的定量化问题,不是家男的非黑即白的问题!!
14楼2013-09-24 12:16:59
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小墨825

新虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-09-23 19:12:33
我想TRITON X-114层再溶解的时候,最好TRITON X-114的浓度还为1%或更低。不知你稀释的倍数是多少,因为大量稀释后,表面活性剂在水溶液中会形成胶束,胶束的粒径可能比你透析或超滤的孔径都大,如果浓度高,那么表 ...

你的想法跟老师提的一样。初始溶液中加入1%的Triton X-114分为上层1和下层1,上层1继续加入1%的Triton X-114,再次分层,得到上层2和下层2,上层2重复上述步骤,得到下层3,合并下层1、2、3使用PBS进行分层,重复2次,得到最终的样品。所以我最终的样品Triton X-114的浓度稀释至原体积之后绝对超过1%了,我拿出一部分来做实验,随着浓缩的进行,溶液越来越黏稠,还是透不过超滤膜,可能稀释倍数还是不够大,浓度超过了cmc,大量稀释再浓缩很浪费时间啊!
15楼2013-09-27 15:19:51
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小墨825

新虫 (小有名气)

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14楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-24 12:16:59
如果表面活性剂在稀溶液中形成了胶束,用透析可能失效,要看具体的胶束的大小,不能一概而论。同样在稀溶液中膜蛋白也会形成沉淀,但是两者的颗粒大小肯定不同,所以可以考虑使用超速离心分离两者。

分离后的膜蛋 ...

在稀溶液中膜蛋白也会形成沉淀,但是两者的颗粒大小肯定不同,所以可以考虑使用超速离心分离两者。——请问这一步的离心机转速要达到多少?就是因为实验室没有超速离心机所以才整得特别麻烦啊!
16楼2013-09-27 15:21:50
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zhzecai

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 小墨825 at 2013-09-27 15:19:51
你的想法跟老师提的一样。初始溶液中加入1%的Triton X-114分为上层1和下层1,上层1继续加入1%的Triton X-114,再次分层,得到上层2和下层2,上层2重复上述步骤,得到下层3,合并下层1、2、3使用PBS进行分层,重复2 ...

您好,我有几个问题想请教您一下,外膜蛋白最终溶解在triton-114中能做直接细胞实验吗?我看有的文献上最终用丙酮进行蛋白质的沉淀,但是我怀疑蛋白质会不会失活啊?还有就算蛋白质沉淀了,那么用哪种溶液能溶解外膜蛋白呢?因为我想用外膜蛋白做细胞实验
17楼2013-10-19 22:56:35
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小墨825

新虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by zhzecai at 2013-10-19 22:56:35
您好,我有几个问题想请教您一下,外膜蛋白最终溶解在triton-114中能做直接细胞实验吗?我看有的文献上最终用丙酮进行蛋白质的沉淀,但是我怀疑蛋白质会不会失活啊?还有就算蛋白质沉淀了,那么用哪种溶液能溶解外 ...

我的经验是丙酮沉淀会大幅失活,不知道你的情况怎么样!
18楼2013-11-27 10:17:06
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hwj110

新虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by zhzecai at 2013-10-19 22:56:35
您好,我有几个问题想请教您一下,外膜蛋白最终溶解在triton-114中能做直接细胞实验吗?我看有的文献上最终用丙酮进行蛋白质的沉淀,但是我怀疑蛋白质会不会失活啊?还有就算蛋白质沉淀了,那么用哪种溶液能溶解外 ...

你好!你用外膜蛋白做实验,最后是怎么解决的啊?是溶解在triton-X114中做的还在重新溶解在其他的溶剂中做的?
19楼2013-11-29 10:18:14
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