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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Triton X-114法提取膜蛋白
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小墨825

新虫 (小有名气)

[求助] Triton X-114法提取膜蛋白

利用Triton X-114法分层得到膜蛋白（下层），怎么把Triton X-114去除？有没有可能将膜蛋白转移到水相？衷心求助！
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1楼 2013-09-17 18:52:04
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小墨825: 金币+20 2013-09-18 15:32:00
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-09-20 00:57:24
膜蛋白在水相中可溶吗（我认为不可溶）？去除表面活性剂之后，蛋白还有活性吗（我认为会沉淀的）？将膜蛋白转移到水相的办法就是用表面活性剂。不可以去除表面活性剂。非要去除表面活性剂的方法也有很多，比如稀释，透析……，但是你的膜蛋白会沉或形成大的聚集体。如果你过分子筛，一定要加表面活性剂，不加的话，蛋白质到了没有表面活性剂助溶的溶液中就会析出，会堵你的分子筛的。表面活性剂一般不影响后续试验，建议保留或换另一种表面活性剂。
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6楼2013-09-18 11:52:01
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-20 00:57:34
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小墨825 at 2013-09-18 16:09:58
我们之前过柱都不去除的，那是因为去垢剂的浓度低，现在经过两相分离，下层都是去污相，呈油状，我也不敢直接上柱，实验室只有superdex 200.但是也要置换成下一步的起始缓冲液，经过您这样提醒似乎置换才是我需要做 ...

对不起，我不太了解你的课题以及实验步骤，我能提供的帮助有限，只说一些个人想法，希望对你有用。
1. 我认为表面活性剂是一头亲水，一头疏水的，那么他与水溶液互溶时，我觉得有两种情况，要么油包水，要么水包油，我觉得分层的现象，应该不是去垢剂的原因，我觉得去垢剂与水是互溶的。不好意思，了解甚少。分层这点希望你能教我。
2. 你说之前过柱都不去除去垢剂，是因为浓度低。我觉得高浓度的表面活性剂能使蛋白质变性，尽管是非离子型的。浓度低一点能提取出来吗？我觉得几个CMC的浓度就应该可以了。
3. 换成另一种表面活性剂是可以的，但是选哪一种表面活性剂是难点。我觉得一般用一种便宜的去垢剂提取，后期换成需要的去垢剂。
互相学习，分层的现象麻烦你教我，你们实验室其他的也分层吗？
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9楼2013-09-18 19:46:31
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小墨825: 金币+5, ★有帮助 2013-09-27 15:31:20
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小墨825 at 2013-09-19 16:44:09
哎呀，您太谦虚啦！我就是利用Triton X-114的方法分层的，非离子表面活性剂Triton X-114溶液在0 ℃下分布均匀，但高于20 ℃时分为水相和去污相（含膜蛋白）。在初始溶液中加入1%的Triton X-114，进行多次分层，收集 ...

根据你给的信息，你油状粘稠的部分，加入缓冲液之后，降低温度，应该会再次溶解，因为你初始溶液中加入1%的Triton X-114是可以溶的，分层之后的 X-114应该也是可以再次溶解的。粘稠的X-114层溶解之后用超滤的方法将蛋白质浓缩，再用浓缩管将里面的溶液换成含有1% triton X-100的溶液，就可以过其他柱子（疏水柱除外）。不知能否帮你。
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11楼2013-09-23 18:59:07
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ynkuaile

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小墨825 at 2013-09-19 16:44:09
哎呀，您太谦虚啦！我就是利用Triton X-114的方法分层的，非离子表面活性剂Triton X-114溶液在0 ℃下分布均匀，但高于20 ℃时分为水相和去污相（含膜蛋白）。在初始溶液中加入1%的Triton X-114，进行多次分层，收集 ...

我想TRITON X-114层再溶解的时候，最好TRITON X-114的浓度还为1%或更低。不知你稀释的倍数是多少，因为大量稀释后，表面活性剂在水溶液中会形成胶束，胶束的粒径可能比你透析或超滤的孔径都大，如果浓度高，那么表面活性剂是透不过去的，超滤也除不掉。我想，分层提取之后，用缓冲液溶解回原来的体积甚至更大，然后超滤浓缩其中的蛋白，然后换成1 % TRITON X-100的溶液。以上是个人想法，仅供参考。我没有做过分层萃取蛋白的实验，我还是有很多问题想你能解答我的。
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12楼2013-09-23 19:12:33
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