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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有没有哪位做过无缝克隆的？有些地方不是很明白，想问问
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xy656691

金虫 (正式写手)

[交流] 有没有哪位做过无缝克隆的？有些地方不是很明白，想问问

试剂盒用的哪个公司的？引物长度是不是要有40多bp，目的片段好扩增吗？实验中要注意什么吗？
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1楼 2013-09-16 14:10:14
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将陈爱喝茶

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-04 10:02:15
xy656691: 金币+5 2014-07-30 15:55:04
试剂盒根据酶的质量,价格也不一样,一般要看你的需求了。
引物长是因为你加上了载体两边的同源序列，以便扩出来以后与载体进行同源重组。
目的片段好不好扩增要看你的片段长度以及引物设计的是否合理了。
实验中主要是重组时间不能过长，最好不要超过25分钟。另外注意载体和你的片段连接的地方序列一定要完全同源，这样连接效率才会高。
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3楼2014-05-03 21:05:42
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)
★
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定个试剂盒 看说明书操作  上次来了个vazyme的销售介绍的有这个，你可以从网上下个他们的说明书，或者直接问他们的技术支持
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4楼2014-05-04 16:23:35
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于止水

新虫 (小有名气)
★
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GBclonart 无缝克隆试剂盒，引物的5端是与载体同源的序列，但3端要保证足够的完全配对的碱基，引物加起来30多到40多,按照说明书来，基本没问题。而且说明书上有需要注意的以及解决办法，还有引物设计示例。
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5楼2014-07-29 16:32:07
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906868558

新虫 (初入文坛)
★
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必克隆的试剂盒，效果和最好的无缝克隆试剂盒完全没有差别，但是价钱却特别便宜，可以放心大胆的用。引物差不多要达到40bp左右，普通pcr的引物也就是20左右嘛，但是由于无缝克隆的过程要有一个同源重组的过程，所以在引物设计上要加上15bp的同源臂，所以是要到40左右。目的片段扩增是否容易本身和无缝克隆这个方法关系不大，要看你的片段长度（必克隆这里引入片段长度可达6kb），复杂性以及引物设计，实验操作等。注意问题的话照着说明书操作就没啥问题，扩增出来的目的片段的纯化建议用切胶回收。
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6楼2014-12-17 17:01:24
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ellin-leu

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 将陈爱喝茶 at 2014-05-03 21:05:42
试剂盒根据酶的质量,价格也不一样,一般要看你的需求了。
引物长是因为你加上了载体两边的同源序列，以便扩出来以后与载体进行同源重组。
目的片段好不好扩增要看你的片段长度以及引物设计的是否合理了。
实验中主 ...

请问，为什么重组时间要求这么严格，最好不超过25min？
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7楼2015-12-26 22:07:41
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
7楼: Originally posted by ellin-leu at 2015-12-26 22:07:41
请问，为什么重组时间要求这么严格，最好不超过25min？...

同源重组酶的特性是这样，如果两个片段没有连接，它会把它们连接起来。而如果两个片段连接在一起，它会把它们切开。
而且因为DNA链断裂产生的能量和DNA连接产生的能量正好相等，同源重组过程是不耗能的，不像T4的BUFFER里面要加很多ATP，但也造成反应进程是平衡反应，最终会变成连接的速度和断裂的速度相等，对克隆很不利。
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8楼2015-12-26 23:01:35
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
诺维赞

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2015-12-27 10:47:01
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westlife9112楼
2013-09-16 14:23   回复  
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