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xy656691

金虫 (正式写手)

[交流] 有没有哪位做过无缝克隆的？有些地方不是很明白，想问问

试剂盒用的哪个公司的？引物长度是不是要有40多bp，目的片段好扩增吗？实验中要注意什么吗？

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1楼 2013-09-16 14:10:14

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siriusxuan

木虫 (正式写手)

应助: 50 (小学生)
金币: 1830
帖子: 509
在线: 151.5小时
虫号: 1992629

★
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引用回帖:

7楼: Originally posted by ellin-leu at 2015-12-26 22:07:41
请问，为什么重组时间要求这么严格，最好不超过25min？...

同源重组酶的特性是这样，如果两个片段没有连接，它会把它们连接起来。而如果两个片段连接在一起，它会把它们切开。
而且因为DNA链断裂产生的能量和DNA连接产生的能量正好相等，同源重组过程是不耗能的，不像T4的BUFFER里面要加很多ATP，但也造成反应进程是平衡反应，最终会变成连接的速度和断裂的速度相等，对克隆很不利。

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8楼2015-12-26 23:01:35

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将陈爱喝茶

铁虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 150.5
帖子: 17
在线: 8.7小时
虫号: 2634429

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-04 10:02:15
xy656691: 金币+5 2014-07-30 15:55:04

试剂盒根据酶的质量,价格也不一样,一般要看你的需求了。
引物长是因为你加上了载体两边的同源序列，以便扩出来以后与载体进行同源重组。
目的片段好不好扩增要看你的片段长度以及引物设计的是否合理了。
实验中主要是重组时间不能过长，最好不要超过25分钟。另外注意载体和你的片段连接的地方序列一定要完全同源，这样连接效率才会高。

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3楼2014-05-03 21:05:42

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