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xy656691

金虫 (正式写手)

[交流] 有没有哪位做过无缝克隆的？有些地方不是很明白，想问问

试剂盒用的哪个公司的？引物长度是不是要有40多bp，目的片段好扩增吗？实验中要注意什么吗？
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1楼2013-09-16 14:10:14
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将陈爱喝茶

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-04 10:02:15
xy656691: 金币+5 2014-07-30 15:55:04
试剂盒根据酶的质量,价格也不一样,一般要看你的需求了。
引物长是因为你加上了载体两边的同源序列，以便扩出来以后与载体进行同源重组。
目的片段好不好扩增要看你的片段长度以及引物设计的是否合理了。
实验中主要是重组时间不能过长，最好不要超过25分钟。另外注意载体和你的片段连接的地方序列一定要完全同源，这样连接效率才会高。
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3楼2014-05-03 21:05:42
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)
★
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定个试剂盒 看说明书操作  上次来了个vazyme的销售介绍的有这个，你可以从网上下个他们的说明书，或者直接问他们的技术支持
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4楼2014-05-04 16:23:35
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于止水

新虫 (小有名气)
★
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GBclonart 无缝克隆试剂盒，引物的5端是与载体同源的序列，但3端要保证足够的完全配对的碱基，引物加起来30多到40多,按照说明书来，基本没问题。而且说明书上有需要注意的以及解决办法，还有引物设计示例。
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5楼2014-07-29 16:32:07
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906868558

新虫 (初入文坛)
★
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必克隆的试剂盒，效果和最好的无缝克隆试剂盒完全没有差别，但是价钱却特别便宜，可以放心大胆的用。引物差不多要达到40bp左右，普通pcr的引物也就是20左右嘛，但是由于无缝克隆的过程要有一个同源重组的过程，所以在引物设计上要加上15bp的同源臂，所以是要到40左右。目的片段扩增是否容易本身和无缝克隆这个方法关系不大，要看你的片段长度（必克隆这里引入片段长度可达6kb），复杂性以及引物设计，实验操作等。注意问题的话照着说明书操作就没啥问题，扩增出来的目的片段的纯化建议用切胶回收。
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6楼2014-12-17 17:01:24
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