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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR总是出现上下拖尾，前后都花费快半个月了，求虫友帮忙
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jxmingcyl

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR总是出现上下拖尾，前后都花费快半个月了，求虫友帮忙

这是我扩增后验证结果，目的条带大小是对的，但是出现上下拖尾了，不知道怎么办，我用的是天根的MIX，引物0.5微升的，模板稀释50和100倍结果是一样的
PCR总是出现上下拖尾，前后都花费快半个月了，求虫友帮忙
AOA扩增出现拖尾
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1楼 2013-09-16 10:53:29
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RUI1990

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以做一个纯阴性对照，即不加模板，看看是否还会出现拖尾现象，出现了说明除模板外有试剂污染，影响PCR。
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做自己
2楼2013-09-16 11:08:48
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firewolfbing

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-16 12:24:25
第一，你的点样量有点大，看mark就知道。
第二，你的特异性还可以，条带还是很单一的。只要做些优化就可以了，不知道你有没有优化了退火温度，如果没有，找下最佳退火应该能解决问题。
第三，天根的mix没用过，不知道Mg加的是多少，你的片段的扩增效率很好，可以适当的降低Mg离子的浓度。
（你的6，7两个条带就很好看啊，很特异，很漂亮。其实你的拖带不明显的，切个胶就能做后续试验了。）
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3楼2013-09-16 11:12:08
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phoenix211

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得这样的结果不影响后续回收吧？
楼主为什么纠结这个呢？
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4楼2013-09-16 14:45:13
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jxmingcyl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by phoenix211 at 2013-09-16 14:45:13
我觉得这样的结果不影响后续回收吧？
楼主为什么纠结这个呢？

我不回收直接去做DGGE，所以这种拖尾就很让人头疼了
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5楼2013-09-16 19:16:34
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冰风颤木

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-17 11:31:36
楼主你好 这个感觉有点特异性扩增了 在PCR的过程中
1、要全部冰浴 可以减少特异性扩增；
2、注意加样顺序
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船到桥头自然直
6楼2013-09-17 11:14:18
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tjwade

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个还好啦 不算怎么拖带 不影响后续DGGE的
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努力刻苦
7楼2013-09-17 11:44:30
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phoenix211

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jxmingcyl at 2013-09-16 19:16:34
我不回收直接去做DGGE，所以这种拖尾就很让人头疼了...

可以是下降低退火温度  也可以试下降低镁离子的浓度  还有就是模板得干净  以前实验里有人做DGGE  模板貌似杂质较多  扩增出来后拖尾比较厉害
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8楼2013-09-17 13:56:06
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hia_25

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在用primer star时，说明书上提过，退火时间的长短可能会影响条带是否出现这样的弥散，楼主可以试一下
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9楼2013-09-17 16:56:34
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laojiu9878

至尊木虫 (文坛精英)

九牛

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
染色试剂多点，在清水浸泡2h
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但愿人长久
10楼2013-09-18 14:15:13
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