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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 单酶切后的补平，发生降解，求指导。
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

[求助] 单酶切后的补平，发生降解，求指导。

我将一个质粒单酶切，然后补平，回收。回收的产物跑胶发生降解。单酶切的产物未降解。不是制胶的问题。

（1）补平时应注意些什么？步骤是什么？体系？条件？
（2）有时候，质粒也发生降解，这是为什么？
求指导。谢谢。
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1楼 2013-09-11 15:17:28
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
Klenow Fragment的补平反应体系及反应条件如下：
A-2:
DNA                               500 ng
10×buffer                      2.5 μl
dNTP                              final 0.1 mM
Klenow                           0.5 U
dH2O                               Up to 25 μl
37℃ 反应30 min ，然后70℃中10min终止反应。
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2楼2013-09-11 15:29:24
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-11 21:38:43
鬼羽帝魂: 金币+3, ★有帮助 2013-10-09 10:30:21
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2013-09-11 15:29:24
Klenow Fragment的补平反应体系及反应条件如下：
A-2:
DNA                               500 ng
10×buffer                      2.5 μl
dNTP                              final 0.1 mM
Klenow       ...

我们一般用T4 DNA polymerase 室温反应5min即可，T4 DNA polymerase的效率是Klenow的200倍

你说你质粒被降解了，那说明你的Klenow里面有核酸酶污染
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-09-11 19:36:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
鬼羽帝魂: 金币+2, ★有帮助 2013-10-09 10:30:28
失活klenow酶之前加EDTA，可以起一定保护作用。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-09-12 00:59:18
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