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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 生物材料 » 纳米生物材料 » 关于EDC/NHS 请教各位大牛
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freezymind

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于EDC/NHS 请教各位大牛

最近在做Fe3O4-Au纳米粒子连赫赛汀（一种单克隆抗体药物）的实验，试了挺多遍都没有理想的结果，各位大牛帮忙看看哪里出问题了：
我的具体步骤：
1、5mg连有PEG-COOH纳米粒子溶于5ml水中，
2、加入固体EDC.HCL 220mg(文献上看来的，50、100mg也都试过）                        
sulfo-NHS 200mg(EDC.HCL/sulfo-NHS 1:1 5:1 10:1也都试过），调节PH至5.0左右，室温卵育15min(30min  1h 2h都试过），
3、硼砂缓冲液调节至7.0（亦曾试过用超滤管去除EDC NHS后调节PH）加入赫赛汀室温2h（室温过夜、4°2h过夜都试过）。

离心后没什么沉淀出来啊，文献上说会有沉淀出现的。请大牛们帮我看看哪里出问题了，感激不尽
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花未眠

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做好实验，好做实验
1楼 2013-08-17 00:04:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sunshaokai

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
markar: 金币+1, 应助指数+1, 感谢回帖交流！ 2013-08-20 22:43:45
引用回帖:
10楼: Originally posted by freezymind at 2013-08-19 10:39:32
大神 你好：
  我昨天按你说的方法试了下：25mg连有PEG-COOH纳米粒子溶于5ml水中，加入固体EDC.HCL 8mg，稍候加入8mg NHS, 今天早上仍然没有离心下来沉淀。
  我看虫友们讨论说DCC/NHS在邮箱也是-COOH的催化剂， ...

1.Fe3O4-Au纳米离子和PEG-COOH是怎么作用上去的？你用的是SH-PEG-COOH？总之，你要保证COOH是游离在外面的！
2.你加多巴胺是做什么用呢，因为它的存在，肯定会消耗点一定量的COOH
2.关于离心沉淀的问题，首先你的PEG-COOH纳米粒子离心会沉淀吗？如果它不沉淀，那么你接上蛋白，它基本也不会沉淀；如果你的PEG-COOH纳米粒子离心沉淀，接上蛋白后，由于蛋白能增加其水溶性（就向蛋白本省你通过离心是离不下来的），也有可能不沉淀了。这反而说明蛋白可能接上去了，你就得通过超滤的办法进行提纯了。
3.关于NHS和EDC的用法用量，（1） Nano Lett. 2002, 2, 817–822.
（2）Anal. Chem. 2010, 82, 1427-1433.
关于邮相转水相（1）Adv. Mater. 2011, 23, 4886-4891.
（2） Biomaterials. 2012, 33, 2215-2222.
其实你参照第一个文献做法，直接包PVP就可以。
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freezymind
11楼2013-08-20 16:30:05
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piaofei123

铁虫 (初入文坛)
干嘛这么麻烦，不如直接去买羧基化的磁珠，然后去接你的单抗
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15楼2013-08-24 10:20:51
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普通回帖

xingjiuwcc

木虫 (著名写手)

新手上路
顶顶

[ 发自小木虫客户端 ]
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一朝踏上读研路，从此妹子是路人
2楼2013-08-17 00:08:04
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zyy880326

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
freezymind: 金币+1, ★有帮助, 金币较少，多多见谅哈 2013-08-17 12:14:34
freezymind: 金币+4, ★★★很有帮助, 感谢达人 2013-08-17 21:22:47
红舟流星: 金币+1, 欢迎来生物材料板块应助交流 2013-08-17 22:33:10
你看下这个贴：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5331024 我觉得你的步骤有问题，一般不这样做吧。还有你的EDC.HCL/sulfo-NHS都是EDC的量高，是不是该NHS的量多投些吧。我最近也在调研文献，也要做这种反应，希望多交流下吧。
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Tostrive,toseek,tofindandnottoyield.
3楼2013-08-17 09:36:42
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freezymind

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zyy880326 at 2013-08-17 09:36:42
你看下这个贴：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5331024 我觉得你的步骤有问题，一般不这样做吧。还有你的EDC.HCL/sulfo-NHS都是EDC的量高，是不是该NHS的量多投些吧。我最近也在调研文献，也要做这种反应 ...

我看文献上基本上都是说EDC要过量的吧，下次可以试试NHS过量。还有我的步骤和链接上的没差别吧，我感觉我要陷入死胡同了。你觉得不妥的地方直接说出来嘛，
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做好实验，好做实验
4楼2013-08-17 12:27:19
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sunshaokai

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
红舟流星: 金币+1, 欢迎来生物材料板块应助交流 2013-08-17 22:33:21
freezymind: 金币+5 2013-08-19 11:24:04
1.你这EDC和NHS加的也太多了吧？我们一般都是几十毫克材料加入几毫克足以。
2.你可以试一下，将50 mg PEG-COOH纳米粒子溶于PBS缓冲溶液中（7.0，中性或偏酸一点活性较好），加入10 mg EDC，10min后加入10 mg NHS（二者摩尔比为1：1即可，稍微多点少点影响不大），反应1h后加入赫赛汀。反应过夜。
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5楼2013-08-17 15:00:03
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freezymind

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sunshaokai at 2013-08-17 15:00:03
1.你这EDC和NHS加的也太多了吧？我们一般都是几十毫克材料加入几毫克足以。
2.你可以试一下，将50 mg PEG-COOH纳米粒子溶于PBS缓冲溶液中（7.0，中性或偏酸一点活性较好），加入10 mg EDC，10min后加入10 mg NHS（ ...

我用的PEG-COOH：EDC：NHS（摩尔比）差不多有1：100：100，是从文献上看下来的，通过这几天看论坛上的，我也觉得加的EDC有点多，一般PEG-COOH： EDC一般是多少比较好？还有，我的实验步骤没什么问题吧？
非常感谢！！！金币稍候奉上，我非化学系的，刚注册的号
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做好实验，好做实验
6楼2013-08-17 16:19:55
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sunshaokai

金虫 (正式写手)
★
markar: 金币+1, 感谢回帖交流！ 2013-08-20 22:43:21
引用回帖:
6楼: Originally posted by freezymind at 2013-08-17 16:19:55
我用的PEG-COOH：EDC：NHS（摩尔比）差不多有1：100：100，是从文献上看下来的，通过这几天看论坛上的，我也觉得加的EDC有点多，一般PEG-COOH： EDC一般是多少比较好？还有，我的实验步骤没什么问题吧？
非常感谢 ...

你可以稍微参考下这个http://wenku.baidu.com/view/ab83173510661ed9ad51f3b4.html
你可以看到从反应机理上看PEG-COOH：EDC：NHS=1：1：1就可以啦。
但是为了要保证转化率，稍微多加一些，但也不至于加到几百倍吧。
在你的试验中：5mg连有PEG-COOH纳米粒子溶于5ml水中，加入固体EDC.HCL 220mg(文献上看来的。PEG-COOH：EDC：NHS（摩尔比）应该不止1：100：100吧。
我觉得你就用我上面给你回复的步骤试一下，应该没有问题。
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7楼2013-08-17 16:53:38
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sunshaokai

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by freezymind at 2013-08-17 16:19:55
我用的PEG-COOH：EDC：NHS（摩尔比）差不多有1：100：100，是从文献上看下来的，通过这几天看论坛上的，我也觉得加的EDC有点多，一般PEG-COOH： EDC一般是多少比较好？还有，我的实验步骤没什么问题吧？
非常感谢 ...

还有pH不用调来调去，你就用中性或者偏酸一点pH就可以的，固定pH的缓冲溶液。在这个范围内对它的活性不是很大。
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8楼2013-08-17 16:55:23
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freezymind

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sunshaokai at 2013-08-17 16:55:23
还有pH不用调来调去，你就用中性或者偏酸一点pH就可以的，固定pH的缓冲溶液。在这个范围内对它的活性不是很大。...

嗯，好的。我先试下。
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做好实验，好做实验
9楼2013-08-17 21:08:52
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freezymind

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sunshaokai at 2013-08-17 16:55:23
还有pH不用调来调去，你就用中性或者偏酸一点pH就可以的，固定pH的缓冲溶液。在这个范围内对它的活性不是很大。...

大神 你好：
  我昨天按你说的方法试了下：25mg连有PEG-COOH纳米粒子溶于5ml水中，加入固体EDC.HCL 8mg，稍候加入8mg NHS, 今天早上仍然没有离心下来沉淀。
  我看虫友们讨论说DCC/NHS在邮箱也是-COOH的催化剂，我纳米粒子溶于水时是2.5mg纳米粒子+100ugDCC+100ug NHS+75ug 多巴胺，会不会是这个过程中把-COOH键消耗掉了？还有，你是怎么把油相纳米粒子溶于水的？我是医学专业的，很多不懂的地方，还请大神不吝赐教，感激不尽！
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做好实验，好做实验
10楼2013-08-19 10:39:32
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