| 查看: 1366 | 回复: 2 | ||
憨憨可爱多木虫 (正式写手)
|
[求助]
AFLP预扩增没有条带 已有1人参与
|
|
酶切连接完跑胶条带不是很亮，而且预扩跑完胶什么都没有，是什么问题？ 步骤跟用量如下： 1.3.1 限制性酶切及连接 在0.5ml离心管中加入（20 ul） 对照 样品 对照模板DNA 4（50ng/ul） DNA模板(浓度:1ul电泳可见即可,或50ng/ul) 4ul adapter 1ul 1ul EcoR I/Mse I 2ul 2ul 10XReaction buffer 2.5ul 2.5ul 10mM ATP 2.5ul 2.5ul T4 Ligase 1ul 1ul AFLP-Water 7ul 7ul 混匀离心数秒 37℃保温5小时 ,8℃保温4小时，4℃过夜。 1.3.2 预扩增反映 在0.5ml或0.2ml离心管中按下列方式加入：体积（25 ul） 模板DNA 2ul Pre-ampmix 1ul dNTP 0.5ul 10×PCR buffer 2.5ul Taq DNA polymerase 0.5ul AFLP-Water 18.5ul 离心数秒，按下列参数进行PCR扩增 ① 预变性 94℃ 2min ② 94℃ 30S，56℃ 30S，72℃ 80S（循环30轮） ③ 延伸加时72℃ 5min 1.3.3 选择性PCR扩增 ⑴ 需选择引物对。（） ⑵ 用AFLP-TE将预扩增产物按1:20稀释，作为选扩模板。 ⑶ 在0.5ml或0.2ml离心管中，按下列方式加入：体积(20ul体系) 预扩增稀释样品 2ul 10×PCR buffer 2.5ul dNTP 0.5ul EcoRI 引物 1ul（共8种，） MseI 引物 1ul（共2种，） Taq 酶 0.5ul AFLP-Water 17.5ul 以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环。 ① 预变性 94℃ 2min ② 第一轮扩增参数：94℃ 30S， 65℃ 30S，72℃ 80S ③ 以后每轮循环温度递减0.7或1℃，扩增14或10轮。 注：递减0.7℃，则扩增14轮，递减1℃则扩增10轮。 ④ 接着按下列参数扩增23轮 94℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 80S ⑤ 延伸加时 72℃ 5min |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有111人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- AFLP选扩弥散，无很明显主带
已经有13人回复
- AFLP差异条带的回收再扩增
已经有6人回复
- AFLP (MSAP) 中双酶切后 预扩增条带很好，选扩增弥散了，求助高手指点啊！万分感谢！
已经有14人回复
- 以酵母基因组为模板进行PCR扩增没有条带
已经有6人回复
- AFLP预扩增不呈现弥散带
已经有8人回复
- 【求助】请教cDNA-AFLP 实验的相关问题，请大家帮忙看看，谢谢
已经有15人回复
- 请问AFLP的选择性扩增引物的第一个选择性碱基为什么是A和C
已经有6人回复
- 【求助/交流】PCR扩增后没有条带是怎么回事?
已经有5人回复
- 【求助/交流】AFLP选择性扩增问题
已经有7人回复
- 【求助/交流】Takara试剂盒，合成cDNA看不到弥散，着急啊
已经有16人回复
zhangyonghu
木虫 (小有名气)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 2123.1
- 散金: 8
- 帖子: 229
- 在线: 142.4小时
- 虫号: 1125036
- 注册: 2010-10-17
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
2楼2013-06-27 16:01:37
lwlskydy
银虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 163.1
- 帖子: 35
- 在线: 13.9小时
- 虫号: 2634219
- 注册: 2013-09-04
- 性别: GG
- 专业: 作物种质资源与遗传育种学
3楼2014-10-24 17:14:20
30