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憨憨可爱多木虫 (正式写手)
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AFLP预扩增没有条带 已有1人参与
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酶切连接完跑胶条带不是很亮，而且预扩跑完胶什么都没有，是什么问题？ 步骤跟用量如下： 1.3.1 限制性酶切及连接 在0.5ml离心管中加入（20 ul） 对照 样品 对照模板DNA 4（50ng/ul） DNA模板(浓度:1ul电泳可见即可,或50ng/ul) 4ul adapter 1ul 1ul EcoR I/Mse I 2ul 2ul 10XReaction buffer 2.5ul 2.5ul 10mM ATP 2.5ul 2.5ul T4 Ligase 1ul 1ul AFLP-Water 7ul 7ul 混匀离心数秒 37℃保温5小时 ,8℃保温4小时，4℃过夜。 1.3.2 预扩增反映 在0.5ml或0.2ml离心管中按下列方式加入：体积（25 ul） 模板DNA 2ul Pre-ampmix 1ul dNTP 0.5ul 10×PCR buffer 2.5ul Taq DNA polymerase 0.5ul AFLP-Water 18.5ul 离心数秒，按下列参数进行PCR扩增 ① 预变性 94℃ 2min ② 94℃ 30S，56℃ 30S，72℃ 80S（循环30轮） ③ 延伸加时72℃ 5min 1.3.3 选择性PCR扩增 ⑴ 需选择引物对。（） ⑵ 用AFLP-TE将预扩增产物按1:20稀释，作为选扩模板。 ⑶ 在0.5ml或0.2ml离心管中，按下列方式加入：体积(20ul体系) 预扩增稀释样品 2ul 10×PCR buffer 2.5ul dNTP 0.5ul EcoRI 引物 1ul（共8种，） MseI 引物 1ul（共2种，） Taq 酶 0.5ul AFLP-Water 17.5ul 以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环。 ① 预变性 94℃ 2min ② 第一轮扩增参数：94℃ 30S， 65℃ 30S，72℃ 80S ③ 以后每轮循环温度递减0.7或1℃，扩增14或10轮。 注：递减0.7℃，则扩增14轮，递减1℃则扩增10轮。 ④ 接着按下列参数扩增23轮 94℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 80S ⑤ 延伸加时 72℃ 5min |
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