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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » AFLP差异条带的回收再扩增
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shucanwei

木虫 (正式写手)

[求助] AFLP差异条带的回收再扩增

诸位好，现在我现在在做从聚丙烯酰胺凝胶中回收条带，然后再做PCR，但是PCR效果很差，如附件中出现的一样，条带不明亮，请问能怎么解决。
PCR体系为：
      buffer            5
      dntp             4
       上下游引物各   1  
      DMSO          3
      Taq               0.5
      DNA              5
      水                 至50ul

     程序为：94读10min;    94读1min；58度1min;72度1min;(37cycles);    72度10min。
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唯以一人治天下，不以天下奉一人。
1楼 2012-11-03 17:33:03
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的资料太不详细了。首先你的片段是多少，你用Taq的话第一步94度10分钟太长了吧，一般2-3min就足够了，太久酶都失活了；另外模版可增加到8ul
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2楼2012-11-06 01:26:48
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shucanwei

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bloodwar at 2012-11-06 01:26:48
你的资料太不详细了。首先你的片段是多少，你用Taq的话第一步94度10分钟太长了吧，一般2-3min就足够了，太久酶都失活了；另外模版可增加到8ul

你好。我获得的片段在500bp左右，大小不等。谢谢你的回复。请问你做这个的实验回收率达到多少呢？能否指导我一下，谢谢。
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唯以一人治天下，不以天下奉一人。
3楼2012-11-07 01:14:40
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peace12039088

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

将目标条带切割下来后，首先加入适量的去离子水，然后在沸水中煮5min左右，再高速离心，取上清作为模板。不知道你是怎么操作的。此外就是预变性10min，太长，3-5min就行了。还有，你的片段500bp的话，退火与延伸30s即可。
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4楼2012-11-07 08:58:10
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fit3525

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

就是感觉预变性的时间太久了，5分钟就可以了，好像你的退火温度有点低~你是要做转录组分析吗？
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5楼2012-11-13 20:46:00
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shucanwei

木虫 (正式写手)
您好，谢谢回复。我做的差异表达基因的筛选，Rna水平。我下次用5min试一下。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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唯以一人治天下，不以天下奉一人。
6楼2012-11-14 21:19:26
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shucanwei

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by fit3525 at 2012-11-13 20:46:00
就是感觉预变性的时间太久了，5分钟就可以了，好像你的退火温度有点低~你是要做转录组分析吗？

我现在用三十七个循环，请问可以增加到四十五个吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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唯以一人治天下，不以天下奉一人。
7楼2012-11-14 21:23:01
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