应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » AFLP差异条带的回收再扩增
71/1返回列表
查看: 849  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

shucanwei

木虫 (正式写手)

[求助] AFLP差异条带的回收再扩增

诸位好，现在我现在在做从聚丙烯酰胺凝胶中回收条带，然后再做PCR，但是PCR效果很差，如附件中出现的一样，条带不明亮，请问能怎么解决。
PCR体系为：
      buffer            5
      dntp             4
       上下游引物各   1  
      DMSO          3
      Taq               0.5
      DNA              5
      水                 至50ul

     程序为：94读10min;    94读1min；58度1min;72度1min;(37cycles);    72度10min。
回复此楼

» 猜你喜欢
唯以一人治天下，不以天下奉一人。
1楼 2012-11-03 17:33:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的资料太不详细了。首先你的片段是多少，你用Taq的话第一步94度10分钟太长了吧，一般2-3min就足够了，太久酶都失活了；另外模版可增加到8ul
赞一下 回复此楼
2楼2012-11-06 01:26:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shucanwei

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bloodwar at 2012-11-06 01:26:48
你的资料太不详细了。首先你的片段是多少，你用Taq的话第一步94度10分钟太长了吧，一般2-3min就足够了，太久酶都失活了；另外模版可增加到8ul

你好。我获得的片段在500bp左右，大小不等。谢谢你的回复。请问你做这个的实验回收率达到多少呢？能否指导我一下，谢谢。
赞一下 回复此楼
唯以一人治天下，不以天下奉一人。
3楼2012-11-07 01:14:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

peace12039088

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

将目标条带切割下来后，首先加入适量的去离子水，然后在沸水中煮5min左右，再高速离心，取上清作为模板。不知道你是怎么操作的。此外就是预变性10min，太长，3-5min就行了。还有，你的片段500bp的话，退火与延伸30s即可。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2012-11-07 08:58:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fit3525

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

就是感觉预变性的时间太久了，5分钟就可以了，好像你的退火温度有点低~你是要做转录组分析吗？
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-13 20:46:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shucanwei

木虫 (正式写手)
您好，谢谢回复。我做的差异表达基因的筛选，Rna水平。我下次用5min试一下。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
唯以一人治天下，不以天下奉一人。
6楼2012-11-14 21:19:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shucanwei

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by fit3525 at 2012-11-13 20:46:00
就是感觉预变性的时间太久了，5分钟就可以了，好像你的退火温度有点低~你是要做转录组分析吗？

我现在用三十七个循环，请问可以增加到四十五个吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
唯以一人治天下，不以天下奉一人。
7楼2012-11-14 21:23:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 shucanwei 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ero8OE6tv9cu 2026-09-02 4/200 2026-09-03 03:14 by rM1TE0WVDIIY
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ero8OE6tv9cu 2026-09-02 6/300 2026-09-02 23:59 by rM1TE0WVDIIY
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +14 Kittylucky 2026-08-27 15/750 2026-09-02 19:35 by liumei0601
[基金申请] 科研人应该花精力去思考如何解决问题，而不是去凝练问题 +7 瞬息宇宙 2026-09-01 14/700 2026-09-02 17:33 by ma0526
[基金申请] 要骂人了，新模版改版就是要淡化问题凝练这种虚的东西，结果有个评委还在说凝练得不够 +9 瞬息宇宙 2026-08-31 17/850 2026-09-02 14:04 by anjeeshine
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 10/500 2026-09-02 11:35 by 大不刘6
[基金申请] 学科评审组评审是指会评吗？ +5 瞬息宇宙 2026-08-31 5/250 2026-09-02 10:13 by 雨冰共舞
[基金申请] 面上函评意见出来了，像什么等级？ 20+4 Tsingking1 2026-08-27 17/850 2026-09-01 19:51 by 超级无敌华子
[论文投稿] 小白求助 投论文要求的highlights应该如何写 5+3 l1963982152 2026-08-29 4/200 2026-09-01 09:04 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +7 gdd2018 2026-08-28 12/600 2026-09-01 08:32 by 尼古拉斯小虫
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +7 雨打竹帘 2026-08-30 11/550 2026-08-31 23:16 by hittle2008
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +6 zhaosm1982 2026-08-27 7/350 2026-08-31 21:18 by qdxxmc
[基金申请] 面上意见出来了 +12 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 23/1150 2026-08-31 18:57 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭