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shucanwei

木虫 (正式写手)

[求助] AFLP差异条带的回收再扩增

诸位好,现在我现在在做从聚丙烯酰胺凝胶中回收条带,然后再做PCR,但是PCR效果很差,如附件中出现的一样,条带不明亮,请问能怎么解决。
PCR体系为:
      buffer            5
      dntp             4
       上下游引物各   1  
      DMSO          3
      Taq               0.5
      DNA              5
      水                 至50ul

     程序为:94读10min;    94读1min;58度1min;72度1min;(37cycles);    72度10min。
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唯以一人治天下,不以天下奉一人。
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的资料太不详细了。首先你的片段是多少,你用Taq的话第一步94度10分钟太长了吧,一般2-3min就足够了,太久酶都失活了;另外模版可增加到8ul
2楼2012-11-06 01:26:48
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shucanwei

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bloodwar at 2012-11-06 01:26:48
你的资料太不详细了。首先你的片段是多少,你用Taq的话第一步94度10分钟太长了吧,一般2-3min就足够了,太久酶都失活了;另外模版可增加到8ul

你好。我获得的片段在500bp左右,大小不等。谢谢你的回复。请问你做这个的实验回收率达到多少呢?能否指导我一下,谢谢。
唯以一人治天下,不以天下奉一人。
3楼2012-11-07 01:14:40
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peace12039088

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

将目标条带切割下来后,首先加入适量的去离子水,然后在沸水中煮5min左右,再高速离心,取上清作为模板。不知道你是怎么操作的。此外就是预变性10min,太长,3-5min就行了。还有,你的片段500bp的话,退火与延伸30s即可。
4楼2012-11-07 08:58:10
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fit3525

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

就是感觉预变性的时间太久了,5分钟就可以了,好像你的退火温度有点低~你是要做转录组分析吗?
5楼2012-11-13 20:46:00
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shucanwei

木虫 (正式写手)

您好,谢谢回复。我做的差异表达基因的筛选,Rna水平。我下次用5min试一下。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
唯以一人治天下,不以天下奉一人。
6楼2012-11-14 21:19:26
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shucanwei

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by fit3525 at 2012-11-13 20:46:00
就是感觉预变性的时间太久了,5分钟就可以了,好像你的退火温度有点低~你是要做转录组分析吗?

我现在用三十七个循环,请问可以增加到四十五个吗?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
唯以一人治天下,不以天下奉一人。
7楼2012-11-14 21:23:01
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