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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】AFLP选择性扩增问题
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niemingyu

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】AFLP选择性扩增问题 已有5人参与

用北京鼎国的AFLP试剂盒做，在选择性扩增过程中，说明书上是配制25微升体系，但鉴于我实际情况，打算配制50微升体系，在下的问题是在反应体系倍增的情况下，以前东东都相应增加多少啊？？
原25体系：
预扩稀释样品：2
10倍PCR buffer 2.5
dNTPs             0.5
两种引物各1微升
Taq 酶      0.5
H2O          17.5
多谢了~
这里祝各位青年节快乐~~！
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1楼 2010-05-04 09:57:42
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
1949stone(金币+1):是个办法 不过好像酶的用量 模板等不用增加一倍吧 2010-05-04 13:53:42
1949stone(金币+1):是个办法 不过好像酶的用量 模板等不用增加一倍吧 2010-05-04 13:53:42
都增加一倍不就行了，这还用问啊
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2楼2010-05-04 13:35:57
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
lstt09nk(金币+1):欢迎回帖交流~~ 2010-05-04 20:55:38
niemingyu(金币+1): 2010-05-07 20:45:44
如果25ul现在没问题，增加一倍是最保险的，酶没有改变的必要，如果为了节约可以摸索一下，但是这跟体系多大没有关系。模板多少一般有个范围，所以改变可能也不影响
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3楼2010-05-04 15:30:20
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amisking

荣誉版主 (文坛精英)

优秀区长优秀版主
niemingyu(金币+1): 2010-05-07 20:46:55
可以直接问鼎国的技术人员。
赞一下 回复此楼
如果没有人帮助你，那么你就去帮助别人。
4楼2010-05-04 20:53:09
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ziyunpy

新虫 (小有名气)
niemingyu(金币+1): 2010-05-07 20:46:49
分别加倍最保险了
要是不够可适当减少酶和模板的用量
其他的用水补上
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努力不等以成功
5楼2010-05-04 22:17:05
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过氧化氢

铁虫 (初入文坛)
加倍就行了
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6楼2010-05-04 23:53:23
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★ ★ ★ ★ ★
niemingyu(金币+5): 2010-05-07 20:46:05
scelab(金币+5):high hand~ :tiger23: 2010-05-07 22:54:15
1、酶加倍并不合理。反应曲线并不是直线线性关系，离子强度是个影响因素。
2、注意引物的浓度，定量到10 or 20 nM使用
3、注意dNTP的浓度。
4、特别注意——定量模板！测光吸收可粗略定量。
5、一定要混匀。

那么，就按照配制体系，一份一份的配就行。
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7楼2010-05-05 02:00:04
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zhwenxing at 2010-05-05 02:00:04:
1、酶加倍并不合理。反应曲线并不是直线线性关系，离子强度是个影响因素。

...

反应曲线是并不是直线线性关系，但是加倍的目的是酶的浓度没有变化，那么对应在曲线点上的位置也没有变化，跟是不是直线线性就没有关系，我不太明白你说的是什么意思？
赞一下 回复此楼
8楼2010-05-07 20:52:47
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