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憨憨可爱多

木虫 (正式写手)

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专业: 林木遗传育种学

[求助] AFLP预扩增没有条带已有1人参与

酶切连接完跑胶条带不是很亮，而且预扩跑完胶什么都没有，是什么问题？

步骤跟用量如下：
1.3.1  限制性酶切及连接

   在0.5ml离心管中加入（20 ul）

                     对照                   样品

   对照模板DNA       4（50ng/ul）

DNA模板(浓度:1ul电泳可见即可,或50ng/ul)    4ul

   adapter             1ul                      1ul

   EcoR I/Mse I       2ul                      2ul

   10XReaction buffer 2.5ul                   2.5ul

   10mM ATP          2.5ul                   2.5ul

T4 Ligase          1ul                      1ul

   AFLP-Water       7ul                      7ul

   混匀离心数秒 37℃保温5小时 ,8℃保温4小时，4℃过夜。

1.3.2  预扩增反映

   在0.5ml或0.2ml离心管中按下列方式加入：体积（25 ul）

模板DNA                      2ul

Pre-ampmix                   1ul

dNTP                         0.5ul

10×PCR buffer                2.5ul

Taq DNA polymerase             0.5ul

AFLP-Water                   18.5ul

离心数秒，按下列参数进行PCR扩增

① 预变性 94℃ 2min

② 94℃ 30S，56℃ 30S，72℃ 80S（循环30轮）

③ 延伸加时72℃ 5min

1.3.3  选择性PCR扩增

   ⑴ 需选择引物对。（）

   ⑵ 用AFLP-TE将预扩增产物按1:20稀释，作为选扩模板。

⑶ 在0.5ml或0.2ml离心管中，按下列方式加入：体积(20ul体系)

   预扩增稀释样品                2ul

   10×PCR buffer                2.5ul

dNTP                         0.5ul

EcoRI 引物                   1ul（共8种，）

   MseI 引物                   1ul（共2种，）

   Taq 酶                      0.5ul

   AFLP-Water                   17.5ul

   以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环。

① 预变性 94℃ 2min

② 第一轮扩增参数：94℃ 30S， 65℃ 30S，72℃ 80S

③ 以后每轮循环温度递减0.7或1℃，扩增14或10轮。

   注：递减0.7℃，则扩增14轮，递减1℃则扩增10轮。

④ 接着按下列参数扩增23轮

   94℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 80S

⑤ 延伸加时 72℃ 5min

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