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hkxya7

金虫 (小有名气)

[求助] 问一下有关PCR-DGGE割胶回收的一些问题

各位大侠，我现在想做一下PCR-DGGE割胶回收，但是对这方面不是很了解，具体操作是怎么进行的，还有我看文献上有一步好像是要将载体转接到大肠杆菌感受态细胞上，我想问一下这一步可不可以不进行。还有就是做这个实验需要什么试剂盒之类的东西。。。。真的很急，求求哪位在这方面有经验的大神能够帮我一下，再不行就真的毕不了业了。。。。。
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1楼2013-06-05 10:39:42
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
hkxya7(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-06 10:59:51
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2楼2013-06-05 11:38:53
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tangjiliang

新虫 (初入文坛)
★ ★
hkxya7(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-06 11:00:04
附录4 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）
操作步骤：第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在15ml漂洗液PW中加入60ml无水乙醇！所有离心步骤均为试用台式离心机在室温下离心。
1.        柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500ul平衡液BL，12,000 rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2.        将单一的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入赶紧离心管中，称取重量。
3.        向胶块中加入3倍体积溶胶液PN；当回收的目的片段< 150bp或琼脂糖凝胶浓度>2%时，建议使用6倍体积溶胶液PN（如溶胶重为0.1g，其体积可视为100μl，以此类推）。50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。
注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。
4.        将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm（~13,400×g）离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
注意：吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批加入。
5.        向吸附柱CA2中加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2~5min再离心。
6.        向吸附柱CA2中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm（~13,400×g）离心30~60秒，倒掉废液。
7.        将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
8.        将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，（如果回收的目的片段>10kb,则洗脱缓冲液EB应置于65～70℃水浴预热），室温放置2min。12,000rpm（~13,400×g）离心2min收集DNA溶液。
注意：DNA也可以用缓冲液（10mM Tris-Cl，pH8.0）洗脱。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤8.
洗脱体积不应小于30μl，体积过少影响回收效率。
洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
DNA浓度及纯度检测
回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
DNA应在OD280处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50ug/ul双链DNA、40ug/ul单链DNA。
OD260/OD280比值应为1.7～1.9，如果洗脱时不适用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
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3楼2013-06-06 10:04:01
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