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anruoka

木虫 (正式写手)

[求助] 重组牛胰蛋白酶在毕赤酵母中的表达 已有1人参与

我们做的是重组牛胰蛋白酶，用的是毕赤酵母GS115
表达量比较低，western blot才能看见
怎么办呢
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我是一只好虫子
1楼 2013-05-25 13:07:27
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
anruoka: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 很详细，谢谢。 2014-07-24 13:07:04
laozuzunzhe: MicEPI+1, good！ 2014-07-24 18:00:33
WB能检测到，那肯定是成功表达了，理论方面也是成立的，没有大问题。
但是毕赤酵母表达外源蛋白表达量低的问题可以从如下方面考虑：
1. 设计方面
a. 该酶是否有关乎表达、折叠等合成过程中关键的酶原或片段。
b. 胞内表达还是胞外表达？一般胞内表达容易受到内毒性的限制；而胞外表达容易受到分泌限制。大多还是设计胞外表达，产酶容易分离纯化。
c. 组成型表达还是诱导型表达？两种表达方式，在后续发酵过程中差别是非常大的。但并不是说一种表达方式一定比另一种高，不同的酶情况不同。一般是两种情况都会做，然后比较。
d. 高拷贝表达：又有2中策略，一是构建高拷贝质粒载体，然后转化筛选重组菌；二是抗生素浓度筛选高拷贝重组菌。但显然前者效果会更加明显，两个方法结合会筛选得到更高拷贝的重组菌。

2. 操作方面
a. 发酵菌种活力：一般选用新在YPD板上活化后的单菌落接种培养。
b. 设置一级种子液是非常有必要的。
c. 发酵起始OD值：理论上起始OD越大，表达量越高。但因受限于摇瓶或发酵罐的大小，而使得情况有所差异。可以考虑多组对照试验。
d. 发酵温度：一般是30度200 rpm，但有文献表面低温发酵，毕赤酵母表达外源蛋白量会增加，可以尝试25-28度。
e. 发酵pH：毕赤酵母发酵过程中，会不断产酸。因此发酵过程中可使用氨水调pH，同时还可以补充氮源。
f. 诱导时间（限诱导型表达方式）：一般在扩增培养达到一定OD值后才会进行甲醇诱导，同时诱导是否成功是关键。若诱导失败，产量会非常低，甚至SDS-PAGE都检测不到。
g. 补料（组成型表达尤为重要）：在发酵液OD值逐渐增大的情况下，需要合理补料，控制溶氧在合适的范围使得菌种迅速增殖产酶。

暂时只能想起这么多，有问题可以多讨论。
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8楼2014-07-23 15:24:20
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heroxuning

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
请问是什么载体的？如果是pPIC9K的，可以使用遗传霉素G418高抗筛选高拷贝，我们一般使用1.0,2.0,3.0,4.0mg/ml浓度
如果是pPICZaA系列，可以考虑 用高浓度Zecion梯度平板筛选高拷贝，
理论上拷贝数多，表达量会高一点，因蛋白而异
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2楼2013-05-25 20:24:40
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anruoka

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by heroxuning at 2013-05-25 20:24:40
请问是什么载体的？如果是pPIC9K的，可以使用遗传霉素G418高抗筛选高拷贝，我们一般使用1.0,2.0,3.0,4.0mg/ml浓度
如果是pPICZaA系列，可以考虑 用高浓度Zecion梯度平板筛选高拷贝，
理论上拷贝数多，表达量会高一 ...

pPICZaA、B、C有什么区别
Zeocin浓度怎么选择
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我是一只好虫子
3楼2013-05-25 21:25:41
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heroxuning

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by anruoka at 2013-05-25 21:25:41
pPICZaA、B、C有什么区别
Zeocin浓度怎么选择...

没什么区别，都是一系列的，中间一些限制性内切酶酶切位点不一样，我们实验室倒梯度平板，先到10mg/ml Zeocin 平板斜面，然后待其凝固，再在高抗斜面上倒无抗固体培养基，使平板保持水平。这样抗生素分子扩散就形成从0---10mg/ml浓度渐变的平板了，在其上涂转化平板上用水冲洗的菌液，长3-4day即可，
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4楼2013-05-25 21:52:20
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