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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
anruoka: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 很详细,谢谢。 2014-07-24 13:07:04
laozuzunzhe: MicEPI+1, good! 2014-07-24 18:00:33
WB能检测到,那肯定是成功表达了,理论方面也是成立的,没有大问题。
但是毕赤酵母表达外源蛋白表达量低的问题可以从如下方面考虑:
1. 设计方面
a. 该酶是否有关乎表达、折叠等合成过程中关键的酶原或片段。
b. 胞内表达还是胞外表达?一般胞内表达容易受到内毒性的限制;而胞外表达容易受到分泌限制。大多还是设计胞外表达,产酶容易分离纯化。
c. 组成型表达还是诱导型表达?两种表达方式,在后续发酵过程中差别是非常大的。但并不是说一种表达方式一定比另一种高,不同的酶情况不同。一般是两种情况都会做,然后比较。
d. 高拷贝表达:又有2中策略,一是构建高拷贝质粒载体,然后转化筛选重组菌;二是抗生素浓度筛选高拷贝重组菌。但显然前者效果会更加明显,两个方法结合会筛选得到更高拷贝的重组菌。

2. 操作方面
a. 发酵菌种活力:一般选用新在YPD板上活化后的单菌落接种培养。
b. 设置一级种子液是非常有必要的。
c. 发酵起始OD值:理论上起始OD越大,表达量越高。但因受限于摇瓶或发酵罐的大小,而使得情况有所差异。可以考虑多组对照试验。
d. 发酵温度:一般是30度200 rpm,但有文献表面低温发酵,毕赤酵母表达外源蛋白量会增加,可以尝试25-28度。
e. 发酵pH:毕赤酵母发酵过程中,会不断产酸。因此发酵过程中可使用氨水调pH,同时还可以补充氮源。
f. 诱导时间(限诱导型表达方式):一般在扩增培养达到一定OD值后才会进行甲醇诱导,同时诱导是否成功是关键。若诱导失败,产量会非常低,甚至SDS-PAGE都检测不到。
g. 补料(组成型表达尤为重要):在发酵液OD值逐渐增大的情况下,需要合理补料,控制溶氧在合适的范围使得菌种迅速增殖产酶。

暂时只能想起这么多,有问题可以多讨论。
8楼2014-07-23 15:24:20
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