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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为啥总是提不出自然界微生物群落的总DNA
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guochuan104

新虫 (初入文坛)

[求助] 为啥总是提不出自然界微生物群落的总DNA

各位大侠，小妹又来问啦~
    小妹我最近做的实验是从载体上收集尽可能多的微生物，提取这些微生物的DNA：
1） 加0.6mL TE悬浮沉淀，并加30µL10%SDS，5µL 20mg/mL蛋白酶K，强烈震荡至均匀，37℃恒温反应0.5~1h。
3) 加1.5mL5mol/LNaCl溶液，混匀。
4) 加1.5mLCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃恒温静置20min。
5) 用等体积氯仿：异戊醇（24:1）抽提两次，轻轻缓慢混匀，8000 r/min,  25℃离心10min，将上清液移至10mL无菌离心管。
6) 加等体积异丙醇，颠倒混匀，室温下静置30min，沉淀DNA。5000r/min离心10min，倒出上层废液，用70%乙醇漂洗后，吸干，溶于适量的TE，-20℃保存，以备后续实验。
   第一次我取了0.2g收集的微生物，沉淀时看到有碎碎的白色碎片，跑胶没看到DNA，第二次取了0.4g，沉淀时有白色薄膜，跑胶看到DNA但没有很亮。中间有别的实验就把提的DNA放冰箱了三天，昨天用引物338-518做RCR，25ul体系里加4ul模板，35个循环，跑胶出来只有引物二聚体！而拿我同门提的养殖场沼渣DNA做对照也P了，有短片段的条带，求问这到底是什么问题~
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1楼 2013-05-09 09:29:22
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zhenwuhuang

至尊木虫 (文学泰斗)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
guochuan104: 金币+5, ★★★很有帮助, 恩恩，很有帮助，我试试其中两三种~谢谢木虫大人~ 2013-05-15 09:16:30
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 21:22:51
活性污泥总DNA不同提取方法的比较。wenku.baidu.com/view/5dea3d67783e0912a2162ac3.html
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2楼2013-05-14 21:26:34
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kaykk

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
guochuan104: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢热心人~ 2013-05-15 14:31:41
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 21:22:27
0.4g DNA 条带不亮，我觉得是不是70% 乙醇漂洗后没有把乙醇彻底去除，还有前一步沉淀DNA 的5000r/min 貌似低了点，我们一般采用10000r/min , 引物二聚体怀疑是引物量过大
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goodluckforusall
3楼2013-05-15 10:29:18
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lmhzy1987

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
guochuan104: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-15 14:38:28
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-15 21:22:36
我个人喜欢二倍体积乙醇沉淀，然后呢12000R/10min
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头疼的文库
4楼2013-05-15 12:12:33
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guochuan104

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kaykk at 2013-05-15 10:29:18
0.4g DNA 条带不亮，我觉得是不是70% 乙醇漂洗后没有把乙醇彻底去除，还有前一步沉淀DNA 的5000r/min 貌似低了点，我们一般采用10000r/min , 引物二聚体怀疑是引物量过大

我是70%乙醇漂洗后用枪尽量把乙醇吸出来，放无菌操作台上吹干，大概吹半个小时，据说吹得很干会导致DNA变性，每次也不敢吹到完全干，就没看到水滴就算了，这样会有影响吗？
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5楼2013-05-15 14:36:06
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guochuan104

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lmhzy1987 at 2013-05-15 12:12:33
我个人喜欢二倍体积乙醇沉淀，然后呢12000R/10min

真的哇？之前论坛上有篇帖子上说不能太大，怕DNA断裂~你离心的效果好吗？
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6楼2013-05-15 14:38:23
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handsomepig
7楼2013-05-15 17:16:19
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