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yanmeiliu金虫 (小有名气)
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[交流]
有哪位在做菊花的原生质体培养吗？或者其他植物的原生质体培养液可以，求经验。 已有3人参与
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如题，我现在做菊花的原生质体培养实验，本实验室没有师兄师姐做过，本科不是学生物的，理论知识比较少，导师也不给指导，所以所有的方法都是自己在摸索，但是现在每次酶解出的原生质体活力都非常的低，所以在培养的时候根本看不到细胞分裂，想了很多改善的方法都没有结果，现在都研二下学期了，很着急，感觉也进行不下去了，唉，每天都实验折磨的都要抑郁了，老板也在变本加厉的折磨我。 哪位前辈做过，能否给些指导？不胜感激。 |
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yanmeiliu
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2楼2013-05-01 12:08:29
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3楼2013-05-01 16:17:53
yanmeiliu
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好的，谢谢您。 下面是我做的具体的步骤： 酶解液的配置：1.5%纤维素酶+0.5%果胶酶+1%MES+0.5mol/L甘露醇 溶于CPW溶液中，55℃ 10min 然后调节ph=5.6，抽滤灭菌备用。 1、取生长35天左右的组培苗，把叶片切成1mm宽左右，在黑暗条件下酶解。 2、每隔2、4、6h 取样观察酶解情况，并检测活力。 3.纯化的过程如下：酶解结束后先过滤，然后1000rmp 5 min ,吸取粗提物注入另一个25%蔗糖的离心管的顶部， 离心1000rmp 3 min，看文献说是原生质体在酶解液和蔗糖溶液间形成一条绿色的带状，感觉我离心出来的并不明显啊。不知道为什么？？哪里出问题了？ 最后是有一条绿色的带状，但是不明显。纯化出来的原生质体感觉和纯化前没区别。并且感觉浪费了很多原生质体。。。操作有问题吗？ 还有，我选的材料用的是菊花的所有叶片，而不是顶芽上的叶片，是不是也有影响呢？ 最关键的是测活力的时候感觉很少原生质体是活的，我是采用番红花红T染色法测定原生质体活力。染液配制：将番红花红T溶于含有甘露醇0.5mol /L的CPW溶液巾，配成浓度为0.1%的染 液备用。取染液和原生质体悬浮液各一滴混合，静置染色3?5min.,光学显微镜下分别计数被染成红色的原生质体数和原生质体的总数，观察10个视野，3次重复。 到底是哪里出问题了？ 请高手帮忙分析一下。谢谢 |
4楼2013-05-01 20:58:39
嘣哆—abc
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初识楼主困境，小生倍有感触！依照楼主的实验目的，小生认为，是所选材料的部位上！虽然植物各个细胞均有一定的细胞全能性，只是这种潜能的大小上有(显著)差异！如生殖细胞>其它体细胞，分生组织(茎基部)细胞>其它组织细胞等等！呵呵～我想聪明的您应当找到答案了！(依照楼主发帖时间，这时菊科植物，尤其是菊花，在这个季节其脚芽特别多！您不妨选用它或根部分生组织！友情提醒，这部分组织材料若从土壤栽培的植物株取来的，要充分灭菌啊！) 一点儿愚见，见笑了！ 恭候佳音～ 愿你有个好心情！～ [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
5楼2013-05-06 21:33:57
yanmeiliu
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呵呵…我是一个业余爱好者！是做遗传方面的！依我愚见，楼主可能没有理解细胞全能性的真正内涵，否则就不会那么草率的选菊花的叶片作材料了！依照菊科植物生物学特征，它茎易木质化，叶片将趋于高度分化！因而，您想重新启动其全能性，就必须得先脱分化，然后再谈其全能性的潜能的激发——获得愈伤组织，接着应当是组织器官的诱导了！(一点愚见，望海涵！记得，百折不挠，不断的寻求突破！加油喔～) 哈哈哈～很高兴认识您～ 我的邮箱670122575@qq.com,有空请给我留言！非诚请勿扰～ 祝你天天有个好心情 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
7楼2013-05-07 12:58:33
yanmeiliu
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8楼2013-05-07 15:40:01
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9楼2013-05-07 20:32:21
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不知道楼主实验进展到什么程度了现在？我曾经也尝试过一些菊花原生质体的分离和培养，不过很遗憾，也没搞成，一直不分裂。不过我可能比较偷懒，也没测它们的活力，我有个问题想请教一下，你能确保你测活力的方法靠谱吗？就是说你测出的活力的结果是否能正确反映它们的真实情况？有没有可能原生质体是活的，但也会认为是死的？ 另外，分离我倒是能分离挺多的原生质体，显微镜下观察比较纯，也挺圆（活力不知道…… ：）），用的材料也是组培苗，这结果，材料很关键，并不是所有叶片都用，最上面的嫩叶不用，最底部的老叶（深绿）不用，用的主要是中部的鲜绿叶片，然后处理的时间方法等等也都需要摸索一下……一点经验，希望能对你有所帮助 |
10楼2013-12-23 09:46:44
