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yanmeiliu金虫 (小有名气)
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[交流]
有哪位在做菊花的原生质体培养吗？或者其他植物的原生质体培养液可以，求经验。 已有3人参与
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如题，我现在做菊花的原生质体培养实验，本实验室没有师兄师姐做过，本科不是学生物的，理论知识比较少，导师也不给指导，所以所有的方法都是自己在摸索，但是现在每次酶解出的原生质体活力都非常的低，所以在培养的时候根本看不到细胞分裂，想了很多改善的方法都没有结果，现在都研二下学期了，很着急，感觉也进行不下去了，唉，每天都实验折磨的都要抑郁了，老板也在变本加厉的折磨我。 哪位前辈做过，能否给些指导？不胜感激。 |
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9楼2013-05-07 20:32:21
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3楼2013-05-01 16:17:53
yanmeiliu
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好的，谢谢您。 下面是我做的具体的步骤： 酶解液的配置：1.5%纤维素酶+0.5%果胶酶+1%MES+0.5mol/L甘露醇 溶于CPW溶液中，55℃ 10min 然后调节ph=5.6，抽滤灭菌备用。 1、取生长35天左右的组培苗，把叶片切成1mm宽左右，在黑暗条件下酶解。 2、每隔2、4、6h 取样观察酶解情况，并检测活力。 3.纯化的过程如下：酶解结束后先过滤，然后1000rmp 5 min ,吸取粗提物注入另一个25%蔗糖的离心管的顶部， 离心1000rmp 3 min，看文献说是原生质体在酶解液和蔗糖溶液间形成一条绿色的带状，感觉我离心出来的并不明显啊。不知道为什么？？哪里出问题了？ 最后是有一条绿色的带状，但是不明显。纯化出来的原生质体感觉和纯化前没区别。并且感觉浪费了很多原生质体。。。操作有问题吗？ 还有，我选的材料用的是菊花的所有叶片，而不是顶芽上的叶片，是不是也有影响呢？ 最关键的是测活力的时候感觉很少原生质体是活的，我是采用番红花红T染色法测定原生质体活力。染液配制：将番红花红T溶于含有甘露醇0.5mol /L的CPW溶液巾，配成浓度为0.1%的染 液备用。取染液和原生质体悬浮液各一滴混合，静置染色3?5min.,光学显微镜下分别计数被染成红色的原生质体数和原生质体的总数，观察10个视野，3次重复。 到底是哪里出问题了？ 请高手帮忙分析一下。谢谢 |
4楼2013-05-01 20:58:39