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长安故人新虫 (小有名气)
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[求助]
PCR 污染 阴性对照个别污染
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如题， 设置的阴性对照数个，其中多数是阴性的结果，而个别几个孔就呈现阳性结果。 而且没有具体的规律可循？ 这样不像是试剂污染呀，气溶胶也不对，我把其中一个放置空气中暴露了的是有时候阳性 有时候阴性 难道是加样枪污染，导致的某个时候操作的不慎导致的？ |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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可能是出现了非特异性扩增带。 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高（大于10mmol/L)、退火温度过低，及PCR循环次数过多（超过30次循环）有关。 其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 再有是：模板(靶基因)核酸的量与纯化程度。模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 |
2楼2013-04-19 18:31:30
noodle-bird
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3楼2013-10-29 09:41:05
