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yuanyuan0827

新虫 (初入文坛)

[求助] TA克隆电击法转化的步骤

现在在做克隆文库,考虑用电击法转化,模板是从土样中提取的DNA然后细菌全长PCR扩增,切胶回收,用pmd-18T载体连接,转化到大肠杆菌细胞中,希望每皿的转化子可达100到200个,求成熟稳定的电击转化参数和步骤
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yuanyuan0827

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by _小小鸟 at 2013-04-18 17:17:39
1. 40微升感受态,于0.5ml离心管中,冰上
2、加入待转化样品(1~2微升),冰上30~60s
3、调节电击仪,电脉冲25微F,电压2.5KV,电阻200欧姆
4、将样品放入电击杯内,电击杯放入电击仪
5、按上述设定的参数,启动 ...

自制感受态细胞的步骤呢
3楼2013-04-19 16:03:00
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_小小鸟

金虫 (正式写手)

御林军

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
yuanyuan0827(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-18 17:18:58
1. 40微升感受态,于0.5ml离心管中,冰上
2、加入待转化样品(1~2微升),冰上30~60s
3、调节电击仪,电脉冲25微F,电压2.5KV,电阻200欧姆
4、将样品放入电击杯内,电击杯放入电击仪
5、按上述设定的参数,启动对细胞的电脉冲(电场强度约为12.5kv/CM)
6、结束后尽快取出,室温下加入1ml SOC培养液
7、37度低速震荡培养1h
8、取不同量菌液(经验值100微)涂布到平板上(X-gal,2%,40微升;IPTG,20%,7微升,/平板)
一米阳光照大地。。。
2楼2013-04-18 17:17:39
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刘仁坤2013

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

自己制备电转感受态细胞效率低,原因是每一步都不可能完全按照分子克隆上的操作,新手到老手的时间怎么着也要一年半载的,一般能达到十的六次方、七次方就不错了,商品化的电转感受态细胞一直大约30元,较贵,而且一般国内的生物公司(像博迈德、全式金等)不生产电转感受态细胞,而且电击用的电击杯按要求是一次性的。总之,电转耗人耗材耗时间。
4楼2013-06-20 11:09:02
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