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关于RNA提取的求助
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| 各位大神，求助！最近在做病毒的RNA提取实验，实际上，本人算是第一次接触分子实验，水平有点渣。用的是试剂盒提取，做了挺多次的了吧，有时候PCR能出来，有时候不能。测OD的结果显示，260/280很多在1.5-1.7左右，甚至1.4的都有，好像说是蛋白质污染严重？？想问下，这个情况大概是什么原因啊？还有，这个情况我应该注意什么？ |
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liyu0355
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3楼2013-12-30 16:46:54
liyu0355
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应用TRIzol LS提取病毒RNA 所提取物为血清、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液等液体中的病毒。提取时尽量在人少时进行，防止空气中RNA酶的污染。所用一切物品也应是无RNA酶的。 1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混匀，室温放置10min。 1.2 加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min （由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。 1.3 离心 4℃、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 1.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。 1.5 离心 4℃、13000r/min、15min，（这时乍一看会发现管子里好像没有东西，再仔细看看，会发现靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物，就是它了）用枪小心吸去所有上清。 1.6 1ml75%乙醇洗一遍，离心 4℃、8000r/min、10min，（这时又会发现管子没东西了，不要担心，有的，但是因为量太少看不见罢了）用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min。 1.7 加入适量DEPC处理水。（如果材料来源丰富的话，加入的水量为下一步RT的total减去其他试剂的量；若要省着点用，则自己看着办了，尽量不要加太多的水）。 1.8 建议立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在－20℃保存1个月左右。 |
4楼2013-12-31 09:51:28
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