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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 想不通找不到原因，到底怎么回事，心烦，rna提取问题
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)

[求助] 想不通找不到原因，到底怎么回事，心烦，rna提取问题

做实验做的好心烦啊，一直在做荧光定量，一直遇到问题，前段时间认为提RNA还算不难，提的效果也不错，不过近来怎么都提不好各种问题，脑子都快气炸了！一套方法一批试剂，前几天提了质量差，觉得是试剂的问题，全部重新配的，今天再做结果是有的好260/280能达到1.9，但是有的很差乱七八糟的，260/280只有1.2左右，260/230比值都有5甚至6的，质量好的是一批材料，不好的是其他批次，怀疑是材料的问题，不过也不应该啊之前这些质量不好的材料还是一样提的出来的质量也不错。
把方法附上吧希望朋友们一起帮我找找原因：

CTAB-LiCl沉淀法稍做改良

1）吸取4mLRNA提取液（2% CTAB(W/v)，2% PP(W/v)，25 mM EDTA，100 mM Tris-Cl pH 8.0，2.0 M NaCl）置于65℃水浴中预热。

2）称取2g样品迅速放入盛有液氮的研钵中研磨成粉末，并转移至含有提取液的离心管中，涡旋混匀器上振荡混匀，使粉末与液体充分接触。

3）加入320?L的β-巯基乙醇及少量亚精胺，混匀，65℃保温5min。冷却至室温加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1 V/V），混匀，于4℃下12000rpm离心20min。吸取上清并重复抽提一次。

4）取上清加入1/4体积10mol/L LiCl于4℃下放置8-16h。

5） 4℃下12000rmp离心30min后加入500?L 无水乙醇洗涤沉淀，4℃12000rmp离心10min，除去上清液。

6）加入500?LSSTE溶解（SSTE buffer：1.0 M NaCl，0.5%SDS，10 mMTris-Cl pH 8.0，1 mM EDTA）沉淀，并加入同体积的氯仿/异戊醇（24：1 V/V）抽提，4℃12000rmp离心20min，吸取上清液。

7）上清液中加入两倍体积的无水乙醇沉淀RNA（-70℃≥30 min）。

8）4℃下12000rmp离心20min，弃上清并用70％乙醇洗2～3次后干燥。

9）用50?L DEPC处理水溶液沉淀，密封保存于-70℃备用。

以上是提取方法，我的材料是果树果实不同发育时期的，以上所有操作均是我一人操作应该排除操作问题，提取质量好坏的样品分歧就出在第5步，质量好的批次此处去完上清后是白色的沉淀，而不好的都带有绿色，紧接着结果导致的是在第8步rna提取出来时，质量好的都是透明的，而有问题的都是略微带些红色或者黄色的，也不透明，我不明白这个红色是什么物质，我用的果实也是绿色的，还有第5及最后出现问题了，我要怎么去处理呢？？？！方法也是用别人的，所以现在出来问题怎么解决自己也理不出头绪，想不到对策，求帮助啊！！！
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
1楼 2013-01-24 19:01:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人觉得是你的心情影响你的实验。建议减少批次的平行实验，一次实验以不超过两小时为佳。最好在开始前好好地休息一下，再开始工作。Enjoy the lab life!
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shine
3楼2013-01-25 09:18:48
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普通回帖

lazag

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
自己没有提过植物的RNA，但是应该有相应试剂盒，质量应该好一些。
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2楼2013-01-24 20:20:44
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你好~我也是果树的，不过我提的是根RNA。用的是invitrgen公司的Trizol试剂，提的浓度跟质量都还可以，就是260/230小了点，最终是透明沉淀。我觉得你那个质量不好的是不是果实中的多糖或酚类？
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
4楼2013-01-25 20:38:57
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhang881007 at 2013-01-25 09:18:48
个人觉得是你的心情影响你的实验。建议减少批次的平行实验，一次实验以不超过两小时为佳。最好在开始前好好地休息一下，再开始工作。Enjoy the lab life!

真心谢谢你！
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
5楼2013-01-27 18:42:51
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 伤何处 at 2013-01-25 20:38:57
你好~我也是果树的，不过我提的是根RNA。用的是invitrgen公司的Trizol试剂，提的浓度跟质量都还可以，就是260/230小了点，最终是透明沉淀。我觉得你那个质量不好的是不是果实中的多糖或酚类？

应该是这样，挺烦燥的还好有大家帮忙！
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
6楼2013-01-27 18:43:23
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zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

心情好了没有？休息了没有？
而有问题的都是略微带些红色或者黄色的，也不透明，我不明白这个红色是什么物质，我用的果实也是绿色的，（因为你的材料是植物材料，这些材料应该是块成熟时高含量的多酚氧化酶产物，其产生的酚类物质，其中多酚类是可于乙醇沉淀的）。
具体是不是，你可以自己再确定下。
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shine
7楼2013-01-29 09:27:36
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhang881007 at 2013-01-29 09:27:36
心情好了没有？休息了没有？
而有问题的都是略微带些红色或者黄色的，也不透明，我不明白这个红色是什么物质，我用的果实也是绿色的，（因为你的材料是植物材料，这些材料应该是块成熟时高含量的多酚氧化酶产物，其 ...

呵呵休息好了，也有人这么讲是酚类物质氧化了，我就多加了些β巯基乙醇结果还是一样，昨天用试剂盒提取，测质量感觉蛮好，一跑胶一片模糊！还想请问你做的是什么材料呢？
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
8楼2013-01-29 11:03:56
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

建议楼至采用trizol或者是试剂盒来提取，还有就是注意枪头的处理，提取的时候勤换手套，并且因为植物材料中多糖和酚类物质的含量会比较多，次生代谢的成份会比较多，所以测出来的260/280，260/230有时会比较低的，多提几次就会好点。祝实验顺利。
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风雪夜归人
9楼2013-01-29 11:14:54
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lebron921

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

改良CTAB发应该是没多大问题的，建议研磨时加入少许PVP在一起研磨，SSTE溶解后氯仿异戊醇可以抽提两次，可以尽量多的抽提掉杂质，RNA的降解一般多出现在研磨和洗沉淀这两步，稍微注意一点应该都没多大问题的，希望你试验顺利
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10楼2013-02-20 23:59:16
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