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想不通找不到原因，到底怎么回事，心烦，rna提取问题
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做实验做的好心烦啊，一直在做荧光定量，一直遇到问题，前段时间认为提RNA还算不难，提的效果也不错，不过近来怎么都提不好各种问题，脑子都快气炸了！一套方法一批试剂，前几天提了质量差，觉得是试剂的问题，全部重新配的，今天再做结果是有的好260/280能达到1.9，但是有的很差乱七八糟的，260/280只有1.2左右，260/230比值都有5甚至6的，质量好的是一批材料，不好的是其他批次，怀疑是材料的问题，不过也不应该啊之前这些质量不好的材料还是一样提的出来的质量也不错。 把方法附上吧希望朋友们一起帮我找找原因： CTAB-LiCl沉淀法稍做改良 1）吸取4mLRNA提取液（2% CTAB(W/v)，2% PP(W/v)，25 mM EDTA，100 mM Tris-Cl pH 8.0，2.0 M NaCl）置于65℃水浴中预热。 2）称取2g样品迅速放入盛有液氮的研钵中研磨成粉末，并转移至含有提取液的离心管中，涡旋混匀器上振荡混匀，使粉末与液体充分接触。 3）加入320?L的β-巯基乙醇及少量亚精胺，混匀，65℃保温5min。冷却至室温加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1 V/V），混匀，于4℃下12000rpm离心20min。吸取上清并重复抽提一次。 4）取上清加入1/4体积10mol/L LiCl于4℃下放置8-16h。 5） 4℃下12000rmp离心30min后加入500?L 无水乙醇洗涤沉淀，4℃12000rmp离心10min，除去上清液。 6）加入500?LSSTE溶解（SSTE buffer：1.0 M NaCl，0.5%SDS，10 mMTris-Cl pH 8.0，1 mM EDTA）沉淀，并加入同体积的氯仿/异戊醇（24：1 V/V）抽提，4℃12000rmp离心20min，吸取上清液。 7）上清液中加入两倍体积的无水乙醇沉淀RNA（-70℃≥30 min）。 8）4℃下12000rmp离心20min，弃上清并用70％乙醇洗2～3次后干燥。 9）用50?L DEPC处理水溶液沉淀，密封保存于-70℃备用。 以上是提取方法，我的材料是果树果实不同发育时期的，以上所有操作均是我一人操作应该排除操作问题，提取质量好坏的样品分歧就出在第5步，质量好的批次此处去完上清后是白色的沉淀，而不好的都带有绿色，紧接着结果导致的是在第8步rna提取出来时，质量好的都是透明的，而有问题的都是略微带些红色或者黄色的，也不透明，我不明白这个红色是什么物质，我用的果实也是绿色的，还有第5及最后出现问题了，我要怎么去处理呢？？？！方法也是用别人的，所以现在出来问题怎么解决自己也理不出头绪，想不到对策，求帮助啊！！！ |
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