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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR

想请教下高手，进行荧光定量PCR进行测定基因表达丰度的相对值的一般步骤是什么呢？
我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火温度，然后再进行SYBR 染料QPCR，这两种PCR的酶是不同的。
通过看溶解曲线发现普通PCR摸索的退火温度用于QPCR并不是最佳的，所以还得用QPCR重新摸索，实在麻烦，还有些会有弱弱的小峰（下面两个溶解曲线可用吗），那就要做浓度梯度做扩增效率了吗？觉得实在是麻烦啊，有点想偷懒了。。。麻烦高手指点下，非常感谢！！！！！！！！！！！！！！！

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1楼 2013-01-22 21:41:23
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-23 16:11:19
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶，看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地，大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线，你是觉得第一张最前面有个小峰，但实际上，如果P出来的是单一目的条带，应该两个温度影响不大
但是，还有一个问题，就是你分析数据的时候，其实看的是起峰的初始Ct值，跟后面的无关的。
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2楼2013-01-22 22:10:43
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mamadexiao at 2013-01-22 22:10:43
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶，看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地，大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线，你是觉得第一张最前面有个小峰，但实际上，如果P出来的是单一目 ...

谢谢你！那一般做QPCR的程序应该是怎样呢？当拿到引物后。。。
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3楼2013-01-22 22:36:37
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mamadexiao at 2013-01-22 22:10:43
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶，看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地，大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线，你是觉得第一张最前面有个小峰，但实际上，如果P出来的是单一目 ...

还有个问题哦，你说分析数据看起峰初始Ct值跟后面的无关，可是如果后面有峰的话，拿到荧光检测阈值的循环数不就变小了吗？不知道这样理解对不对，有点困惑。
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4楼2013-01-22 22:40:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励应助 2013-01-23 16:11:45
如果熔解曲线中出现不同的峰说明产物不单一。跑胶的灵敏度远远比不上荧光定量的检测线，胶上一条带不能说明没有非特异扩增和引物二聚体的存在。你图上所说的小峰在定量时肯定会影响结果的。你可以检测一下扩增效率，出现其他峰的反应的扩增效率会偏高，读出的CT值偏小。引物的扩增效率是要做的，否则你用来计算2^(-ΔΔCT)的根据在哪里呢？出现其他峰是和引物设计有关的。可能是引物特异性差或是形成二聚体。
对于退火温度的优化，是要用qPCR的体系的。你也发现了，不同体系得到的最优温度也是不同的。不过可以先用普通PCR检测一下引物是否能P出目的条带，掌握大致的退火温度。
做荧光定量不能怕麻烦，各种条件控制好才能得到可信度高的数据。
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shiliyusly
5楼2013-01-23 08:26:06
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匿名

用户注销 (小有名气)
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+2, ★有帮助 2013-01-23 09:42:20
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-23 16:11:55
本帖仅楼主可见
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6楼2013-01-23 08:28:04
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by qitianyang at 2013-01-23 08:28:04
我们的习惯一般都是直接上real-time，一般以60度为qPCR最佳温度，做几个温度梯度的测试。看一下各个温度下的扩增曲线和溶解曲线，然后再跑一下普通PCR，看一下条带的位置是不是你所设计的大小。...

非常感谢！！！！请问你们做温度梯度是QPCR仪器有这个功能还是自己一次一个温度，多做几个温度呢？
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7楼2013-01-23 09:42:08
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匿名

用户注销 (小有名气)
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8楼2013-01-23 09:44:10
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+1, ★有帮助 2013-01-23 11:08:55
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-23 16:12:03
我们一般都不用普通PCR摸索一下退火温度，用的是Taq酶，然后再上qRT-PCR，按照一般标准，20ul体系，SYBR染料，溶解曲线不是一个峰的话，说明有引物二聚体，我认为只要普通PCR做的时候没有引物二聚体，qRT-PCR也不会有的，反正我都是这样做的，结果都挺好的。。。
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keepon
9楼2013-01-23 10:56:02
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-23 08:26:06
如果熔解曲线中出现不同的峰说明产物不单一。跑胶的灵敏度远远比不上荧光定量的检测线，胶上一条带不能说明没有非特异扩增和引物二聚体的存在。你图上所说的小峰在定量时肯定会影响结果的。你可以检测一下扩增效率， ...

非常感谢！但我主要做的是比较不同品种的同个基因的相对定量，那是不是对单峰，扩增效率的要求就不需要那么高了呢，因为不同品种都一样，不是最优大家都不是最优。
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10楼2013-01-23 11:03:12
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