应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » QPCR
141/2返回列表12下一页
查看: 1860  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR

想请教下高手，进行荧光定量PCR进行测定基因表达丰度的相对值的一般步骤是什么呢？
我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火温度，然后再进行SYBR 染料QPCR，这两种PCR的酶是不同的。
通过看溶解曲线发现普通PCR摸索的退火温度用于QPCR并不是最佳的，所以还得用QPCR重新摸索，实在麻烦，还有些会有弱弱的小峰（下面两个溶解曲线可用吗），那就要做浓度梯度做扩增效率了吗？觉得实在是麻烦啊，有点想偷懒了。。。麻烦高手指点下，非常感谢！！！！！！！！！！！！！！！

ACT比较.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累 【分子生物】EPI帖 PCR问题集锦

» 猜你喜欢
1楼 2013-01-22 21:41:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励应助 2013-01-23 16:11:45
如果熔解曲线中出现不同的峰说明产物不单一。跑胶的灵敏度远远比不上荧光定量的检测线，胶上一条带不能说明没有非特异扩增和引物二聚体的存在。你图上所说的小峰在定量时肯定会影响结果的。你可以检测一下扩增效率，出现其他峰的反应的扩增效率会偏高，读出的CT值偏小。引物的扩增效率是要做的，否则你用来计算2^(-ΔΔCT)的根据在哪里呢？出现其他峰是和引物设计有关的。可能是引物特异性差或是形成二聚体。
对于退火温度的优化，是要用qPCR的体系的。你也发现了，不同体系得到的最优温度也是不同的。不过可以先用普通PCR检测一下引物是否能P出目的条带，掌握大致的退火温度。
做荧光定量不能怕麻烦，各种条件控制好才能得到可信度高的数据。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

shiliyusly
5楼2013-01-23 08:26:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-23 16:11:19
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶，看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地，大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线，你是觉得第一张最前面有个小峰，但实际上，如果P出来的是单一目的条带，应该两个温度影响不大
但是，还有一个问题，就是你分析数据的时候，其实看的是起峰的初始Ct值，跟后面的无关的。
赞一下 回复此楼
2楼2013-01-22 22:10:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mamadexiao at 2013-01-22 22:10:43
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶，看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地，大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线，你是觉得第一张最前面有个小峰，但实际上，如果P出来的是单一目 ...

谢谢你！那一般做QPCR的程序应该是怎样呢？当拿到引物后。。。
赞一下 回复此楼
3楼2013-01-22 22:36:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mamadexiao at 2013-01-22 22:10:43
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶，看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地，大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线，你是觉得第一张最前面有个小峰，但实际上，如果P出来的是单一目 ...

还有个问题哦，你说分析数据看起峰初始Ct值跟后面的无关，可是如果后面有峰的话，拿到荧光检测阈值的循环数不就变小了吗？不知道这样理解对不对，有点困惑。
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-22 22:40:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+2, ★有帮助 2013-01-23 09:42:20
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-23 16:11:55
本帖仅楼主可见
赞一下
6楼2013-01-23 08:28:04
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by qitianyang at 2013-01-23 08:28:04
我们的习惯一般都是直接上real-time，一般以60度为qPCR最佳温度，做几个温度梯度的测试。看一下各个温度下的扩增曲线和溶解曲线，然后再跑一下普通PCR，看一下条带的位置是不是你所设计的大小。...

非常感谢！！！！请问你们做温度梯度是QPCR仪器有这个功能还是自己一次一个温度，多做几个温度呢？
赞一下 回复此楼
7楼2013-01-23 09:42:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
8楼2013-01-23 09:44:10
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+1, ★有帮助 2013-01-23 11:08:55
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-23 16:12:03
我们一般都不用普通PCR摸索一下退火温度，用的是Taq酶，然后再上qRT-PCR，按照一般标准，20ul体系，SYBR染料，溶解曲线不是一个峰的话，说明有引物二聚体，我认为只要普通PCR做的时候没有引物二聚体，qRT-PCR也不会有的，反正我都是这样做的，结果都挺好的。。。
赞一下 回复此楼
keepon
9楼2013-01-23 10:56:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-23 08:26:06
如果熔解曲线中出现不同的峰说明产物不单一。跑胶的灵敏度远远比不上荧光定量的检测线，胶上一条带不能说明没有非特异扩增和引物二聚体的存在。你图上所说的小峰在定量时肯定会影响结果的。你可以检测一下扩增效率， ...

非常感谢！但我主要做的是比较不同品种的同个基因的相对定量，那是不是对单峰，扩增效率的要求就不需要那么高了呢，因为不同品种都一样，不是最优大家都不是最优。
赞一下 回复此楼
10楼2013-01-23 11:03:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 shiliyusly 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 311求调剂 +9 冬十三 2026-03-15 10/500 2026-03-17 22:53 by lbsjt
[考研] 材料，纺织，生物（0856、0710），化学招生啦 +3 Eember. 2026-03-17 7/350 2026-03-17 20:20 by 花125533
[考研] 293求调剂 +7 zjl的号 2026-03-16 12/600 2026-03-17 18:22 by 重科小霸王
[考研] 材料专硕306英一数二 +7 z1z2z3879 2026-03-16 9/450 2026-03-17 17:31 by ccjequ
[考研] 344求调剂 +4 knight344 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:27 by ruiyingmiao
[考研] 【0856】化学工程（085602）313 分，本科学科评估A类院校化学工程与工艺，诚求调剂 +7 小刘快快上岸 2026-03-11 8/400 2026-03-17 16:57 by ruiyingmiao
[考研] 26考研求调剂 +6 丶宏Sir 2026-03-13 6/300 2026-03-17 16:13 by 醉在风里
[考研] 药学383 求调剂 +3 药学chy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 20:51 by 元子^0^
[考研] 0854控制工程 359求调剂 可跨专业 +3 626776879 2026-03-14 9/450 2026-03-16 17:42 by 626776879
[考研] 070303 总分349求调剂 +3 LJY9966 2026-03-15 5/250 2026-03-16 14:24 by xwxstudy
[考研] 0703 物理化学调剂 +3 我可以上岸的对� 2026-03-13 5/250 2026-03-16 10:50 by 我可以上岸的对�
[考研] 327求调剂 +6 拾光任染 2026-03-15 11/550 2026-03-15 22:47 by 拾光任染
[考研] 26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂 +3 嘉年新程 2026-03-15 3/150 2026-03-15 13:58 by 哈哈哈哈嘿嘿嘿
[考研] 复试调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-14 3/150 2026-03-14 16:53 by WTUChen
[考研] 331求调剂（0703有机化学 +5 ZY-05 2026-03-13 6/300 2026-03-14 10:51 by Jy?
[基金申请] 有必要更换申报口吗 20+3 fannyamoy 2026-03-11 3/150 2026-03-14 00:52 by zhanghaozhu
[考研] 求调剂（材料与化工327） +4 爱吃香菜啦 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:11 by JourneyLucky
[考研] 0856材料与化工301求调剂 +5 奕束光 2026-03-13 5/250 2026-03-13 22:00 by 星空星月
[考研] 281求调剂 +9 Koxui 2026-03-12 11/550 2026-03-13 20:50 by Koxui
[考博] 福州大学杨黄浩课题组招收2026年专业学位博士研究生，2026.03.20截止 +3 Xiangyu_ou 2026-03-12 3/150 2026-03-13 09:36 by duanwu655
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭