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shiliyusly新虫 (小有名气)
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[求助]
QPCR
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 想请教下高手，进行荧光定量PCR进行测定基因表达丰度的相对值的一般步骤是什么呢？我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火温度，然后再进行SYBR 染料QPCR，这两种PCR的酶是不同的。 通过看溶解曲线发现普通PCR摸索的退火温度用于QPCR并不是最佳的，所以还得用QPCR重新摸索，实在麻烦，还有些会有弱弱的小峰（下面两个溶解曲线可用吗），那就要做浓度梯度做扩增效率了吗？觉得实在是麻烦啊，有点想偷懒了。。。麻烦高手指点下，非常感谢！！！！！！！！！！！！！！！  ACT比较.jpg |
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 分子生化实验经验积累 | 【分子生物】EPI帖 | PCR问题集锦 |
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【答案】应助回帖
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如果熔解曲线中出现不同的峰说明产物不单一。跑胶的灵敏度远远比不上荧光定量的检测线，胶上一条带不能说明没有非特异扩增和引物二聚体的存在。你图上所说的小峰在定量时肯定会影响结果的。你可以检测一下扩增效率，出现其他峰的反应的扩增效率会偏高，读出的CT值偏小。引物的扩增效率是要做的，否则你用来计算2^(-ΔΔCT)的根据在哪里呢？出现其他峰是和引物设计有关的。可能是引物特异性差或是形成二聚体。 对于退火温度的优化，是要用qPCR的体系的。你也发现了，不同体系得到的最优温度也是不同的。不过可以先用普通PCR检测一下引物是否能P出目的条带，掌握大致的退火温度。 做荧光定量不能怕麻烦，各种条件控制好才能得到可信度高的数据。 |
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shiliyusly5楼2013-01-23 08:26:06
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