| 查看: 1862 | 回复: 13 | |||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
shiliyusly新虫 (小有名气)
|
[求助]
QPCR
|
||||
 想请教下高手，进行荧光定量PCR进行测定基因表达丰度的相对值的一般步骤是什么呢？我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火温度，然后再进行SYBR 染料QPCR，这两种PCR的酶是不同的。 通过看溶解曲线发现普通PCR摸索的退火温度用于QPCR并不是最佳的，所以还得用QPCR重新摸索，实在麻烦，还有些会有弱弱的小峰（下面两个溶解曲线可用吗），那就要做浓度梯度做扩增效率了吗？觉得实在是麻烦啊，有点想偷懒了。。。麻烦高手指点下，非常感谢！！！！！！！！！！！！！！！  ACT比较.jpg |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 【分子生物】EPI帖 | PCR问题集锦 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有191人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
shiliyusly
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 265.4
- 散金: 17
- 红花: 1
- 帖子: 138
- 在线: 71.5小时
- 虫号: 1434769
- 注册: 2011-10-10
- 专业: 食品科学基础
4楼2013-01-22 22:40:37
mamadexiao
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 53 (初中生)
- 金币: 5603.5
- 散金: 100
- 红花: 7
- 帖子: 418
- 在线: 78.8小时
- 虫号: 576831
- 注册: 2008-06-21
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
2楼2013-01-22 22:10:43
shiliyusly
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 265.4
- 散金: 17
- 红花: 1
- 帖子: 138
- 在线: 71.5小时
- 虫号: 1434769
- 注册: 2011-10-10
- 专业: 食品科学基础
3楼2013-01-22 22:36:37
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励应助 2013-01-23 16:11:45
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励应助 2013-01-23 16:11:45
|
如果熔解曲线中出现不同的峰说明产物不单一。跑胶的灵敏度远远比不上荧光定量的检测线，胶上一条带不能说明没有非特异扩增和引物二聚体的存在。你图上所说的小峰在定量时肯定会影响结果的。你可以检测一下扩增效率，出现其他峰的反应的扩增效率会偏高，读出的CT值偏小。引物的扩增效率是要做的，否则你用来计算2^(-ΔΔCT)的根据在哪里呢？出现其他峰是和引物设计有关的。可能是引物特异性差或是形成二聚体。 对于退火温度的优化，是要用qPCR的体系的。你也发现了，不同体系得到的最优温度也是不同的。不过可以先用普通PCR检测一下引物是否能P出目的条带，掌握大致的退火温度。 做荧光定量不能怕麻烦，各种条件控制好才能得到可信度高的数据。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
shiliyusly5楼2013-01-23 08:26:06
