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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

MolEPI: 10
应助: 1662 (讲师)
金币: 8693.8
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帖子: 3516
在线: 456小时
虫号: 1614001
注册: 2012-02-13
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励应助 2013-01-23 16:11:45

如果熔解曲线中出现不同的峰说明产物不单一。跑胶的灵敏度远远比不上荧光定量的检测线，胶上一条带不能说明没有非特异扩增和引物二聚体的存在。你图上所说的小峰在定量时肯定会影响结果的。你可以检测一下扩增效率，出现其他峰的反应的扩增效率会偏高，读出的CT值偏小。引物的扩增效率是要做的，否则你用来计算2^(-ΔΔCT)的根据在哪里呢？出现其他峰是和引物设计有关的。可能是引物特异性差或是形成二聚体。
对于退火温度的优化，是要用qPCR的体系的。你也发现了，不同体系得到的最优温度也是不同的。不过可以先用普通PCR检测一下引物是否能P出目的条带，掌握大致的退火温度。
做荧光定量不能怕麻烦，各种条件控制好才能得到可信度高的数据。

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shiliyusly

5楼2013-01-23 08:26:06

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