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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR

想请教下高手,进行荧光定量PCR进行测定基因表达丰度的相对值的一般步骤是什么呢?
我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火温度,然后再进行SYBR 染料QPCR,这两种PCR的酶是不同的。
通过看溶解曲线发现普通PCR摸索的退火温度用于QPCR并不是最佳的,所以还得用QPCR重新摸索,实在麻烦,还有些会有弱弱的小峰(下面两个溶解曲线可用吗),那就要做浓度梯度做扩增效率了吗?觉得实在是麻烦啊,有点想偷懒了。。。麻烦高手指点下,非常感谢!!!!!!!!!!!!!!!

ACT比较.jpg
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-23 08:26:06
如果熔解曲线中出现不同的峰说明产物不单一。跑胶的灵敏度远远比不上荧光定量的检测线,胶上一条带不能说明没有非特异扩增和引物二聚体的存在。你图上所说的小峰在定量时肯定会影响结果的。你可以检测一下扩增效率, ...

非常感谢!但我主要做的是比较不同品种的同个基因的相对定量,那是不是对单峰,扩增效率的要求就不需要那么高了呢,因为不同品种都一样,不是最优大家都不是最优。
10楼2013-01-23 11:03:12
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-23 16:11:19
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶,看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地,大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线,你是觉得第一张最前面有个小峰,但实际上,如果P出来的是单一目的条带,应该两个温度影响不大
但是,还有一个问题,就是你分析数据的时候,其实看的是起峰的初始Ct值,跟后面的无关的。
2楼2013-01-22 22:10:43
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mamadexiao at 2013-01-22 22:10:43
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶,看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地,大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线,你是觉得第一张最前面有个小峰,但实际上,如果P出来的是单一目 ...

谢谢你!那一般做QPCR的程序应该是怎样呢?当拿到引物后。。。
3楼2013-01-22 22:36:37
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mamadexiao at 2013-01-22 22:10:43
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶,看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地,大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线,你是觉得第一张最前面有个小峰,但实际上,如果P出来的是单一目 ...

还有个问题哦,你说分析数据看起峰初始Ct值跟后面的无关,可是如果后面有峰的话,拿到荧光检测阈值的循环数不就变小了吗?不知道这样理解对不对,有点困惑。
4楼2013-01-22 22:40:37
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