24小时热门版块排行榜    

查看: 2112  |  回复: 13
本帖产生 1 个 MolEPI ,点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR

想请教下高手,进行荧光定量PCR进行测定基因表达丰度的相对值的一般步骤是什么呢?
我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火温度,然后再进行SYBR 染料QPCR,这两种PCR的酶是不同的。
通过看溶解曲线发现普通PCR摸索的退火温度用于QPCR并不是最佳的,所以还得用QPCR重新摸索,实在麻烦,还有些会有弱弱的小峰(下面两个溶解曲线可用吗),那就要做浓度梯度做扩增效率了吗?觉得实在是麻烦啊,有点想偷懒了。。。麻烦高手指点下,非常感谢!!!!!!!!!!!!!!!

ACT比较.jpg
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)

本帖仅楼主可见
8楼2013-01-23 09:44:10
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页
查看全部 14 个回答

mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-23 16:11:19
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶,看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地,大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线,你是觉得第一张最前面有个小峰,但实际上,如果P出来的是单一目的条带,应该两个温度影响不大
但是,还有一个问题,就是你分析数据的时候,其实看的是起峰的初始Ct值,跟后面的无关的。
2楼2013-01-22 22:10:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mamadexiao at 2013-01-22 22:10:43
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶,看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地,大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线,你是觉得第一张最前面有个小峰,但实际上,如果P出来的是单一目 ...

谢谢你!那一般做QPCR的程序应该是怎样呢?当拿到引物后。。。
3楼2013-01-22 22:36:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mamadexiao at 2013-01-22 22:10:43
摸引物条件的时候要求你最后去跑个胶,看下你的引物在不同退火温度下的条带是不是单一可用地,大小是否符合你设计的产物大小。
再说你的这溶解曲线,你是觉得第一张最前面有个小峰,但实际上,如果P出来的是单一目 ...

还有个问题哦,你说分析数据看起峰初始Ct值跟后面的无关,可是如果后面有峰的话,拿到荧光检测阈值的循环数不就变小了吗?不知道这样理解对不对,有点困惑。
4楼2013-01-22 22:40:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 职称评审,求友友推荐见刊最快的期刊 +3 工厂打螺丝 2026-08-08 3/150 2026-08-11 13:42 by 会议编辑
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 6/300 2026-08-11 13:19 by JACS/Angew
[基金申请] filecode +9 documentary 2026-08-10 9/450 2026-08-11 10:08 by wk7465
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +15 Lanmanbaby 2026-08-09 23/1150 2026-08-11 09:51 by demonstreets
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分? +10 yufeiwaner 2026-08-09 11/550 2026-08-10 18:47 by yufeiwaner
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +3 majunge000 2026-08-10 3/150 2026-08-10 15:46 by lch2012
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 8月时间戳变的,举个手。玩一下,释放压力 +11 archvillain 2026-08-04 13/650 2026-08-10 14:41 by seekfind
[基金申请] 好奇怪的filecode +4 布布和一二 2026-08-08 5/250 2026-08-10 14:20 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] 关于filecode,很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制,评价高的钱多评价低的钱少,但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变,有变的大神么? +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 固定端突然变了,今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 好消息?这个有何含义??? +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
信息提示
请填处理意见