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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-01-23 10:56:02
我们一般都不用普通PCR摸索一下退火温度，用的是Taq酶，然后再上qRT-PCR，按照一般标准，20ul体系，SYBR染料，溶解曲线不是一个峰的话，说明有引物二聚体，我认为只要普通PCR做的时候没有引物二聚体，qRT-PCR也不会 ...

谢谢！有些引物二聚体是不是可以忽略呢？40多个循环
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11楼2013-01-23 11:09:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-23 16:12:15
shiliyusly: 金币+2, ★有帮助 2013-01-23 19:41:25
引用回帖:
10楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-01-23 11:03:12
非常感谢！但我主要做的是比较不同品种的同个基因的相对定量，那是不是对单峰，扩增效率的要求就不需要那么高了呢，因为不同品种都一样，不是最优大家都不是最优。...

不知道你怎样得到这种想法的。在我看来，如果扩增出来的产物不单一的引物不能用做定量。因为定量的时候测的是荧光。如果除了目的产物之外有其它东西也会发出荧光，读出的CT是不准确的。
你说如果不是最优的话大家都不是最优也有问题的。不能小看这个小峰的。你会发现目标mRNA丰度高的样品小峰相对会比较低，对那些丰度低的样品非特异扩增和引物二聚体的峰会更明显。
我建议你多设计几对引物，选一对最好的做实验。
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12楼2013-01-23 14:36:33
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-23 14:36:33
不知道你怎样得到这种想法的。在我看来，如果扩增出来的产物不单一的引物不能用做定量。因为定量的时候测的是荧光。如果除了目的产物之外有其它东西也会发出荧光，读出的CT是不准确的。
你说如果不是最优的话大家 ...

我这个是听仪器技术支持说的。那只能重新设计引物了。非常感谢你！
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13楼2013-01-23 19:41:19
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-01-23 11:09:54
谢谢！有些引物二聚体是不是可以忽略呢？40多个循环...

肯定不能忽略啊。。。会影响Ct值的。。到时候计算出的结果就不太可靠了。。。重新设计引物吧。。。
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keepon
14楼2013-01-23 21:10:15
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