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shiliyusly新虫 (小有名气)
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QPCR
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 想请教下高手，进行荧光定量PCR进行测定基因表达丰度的相对值的一般步骤是什么呢？我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火温度，然后再进行SYBR 染料QPCR，这两种PCR的酶是不同的。 通过看溶解曲线发现普通PCR摸索的退火温度用于QPCR并不是最佳的，所以还得用QPCR重新摸索，实在麻烦，还有些会有弱弱的小峰（下面两个溶解曲线可用吗），那就要做浓度梯度做扩增效率了吗？觉得实在是麻烦啊，有点想偷懒了。。。麻烦高手指点下，非常感谢！！！！！！！！！！！！！！！  ACT比较.jpg |
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cicelyzh
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-23 16:12:15
shiliyusly: 金币+2, ★有帮助 2013-01-23 19:41:25
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shiliyusly: 金币+2, ★有帮助 2013-01-23 19:41:25
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不知道你怎样得到这种想法的。在我看来，如果扩增出来的产物不单一的引物不能用做定量。因为定量的时候测的是荧光。如果除了目的产物之外有其它东西也会发出荧光，读出的CT是不准确的。 你说如果不是最优的话大家都不是最优也有问题的。不能小看这个小峰的。你会发现目标mRNA丰度高的样品小峰相对会比较低，对那些丰度低的样品非特异扩增和引物二聚体的峰会更明显。 我建议你多设计几对引物，选一对最好的做实验。 |
12楼2013-01-23 14:36:33
mamadexiao
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2楼2013-01-22 22:10:43
shiliyusly
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3楼2013-01-22 22:36:37
shiliyusly
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4楼2013-01-22 22:40:37