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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求高人指点qpcr问题，扩增效率太高！
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求高人指点qpcr问题，扩增效率太高！

最近做荧光定量，问题重重，先是跑了个内参试试，做个标曲，结果出来了，扩增效率很高，达到200%，不过溶解曲线却是单一峰；还有就是ntc也有值，搞不明白，跑了个胶发现有条带应该是引物二聚体吧，我新手也不确定。上图吧，求分析，求帮助！
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
1楼 2013-01-14 21:05:07
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hubinghello

金虫 (小有名气)
同求！我曾经扩增效率到800%，问题还没解决。觉得是引物问题。
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去爱吧，像不曾爱过一样；跳舞吧，像没有人观看一样；唱歌吧，像没有人聆听一样；生活吧，像每天都是世界末日一样；赚钱吧，像不是为了钱一样。
3楼2013-01-14 22:23:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
扩增效率高一般是说明有非特异性扩增或者有引物二聚体。
如果有引物二聚体，熔解曲线上会有比产物温度低的峰出现。一般的正常产物熔解温度高于80°C，引物二聚体的熔解温度会比较低，一般是七十多度。虽然你说熔解曲线是单一的峰，但在我看来，在70-80°C之间有两个不明显的小峰，从左边的图也能看出有三处slop的变化。温度低的小峰在负对照中明显放大。只有高于84°C的那个是正常产物。这个图已经很明显的表示扩增不特异。从跑的胶的图上看，似乎有引物二聚体和单体，也可能是非特异产物。你的PCR体系中引物的浓度用的是多少？是不是太高了。此外，你是否对引物做了温度梯度确定最佳退火温度。
你的负对照扩增产物的熔解曲线明显只有温度低的峰，没有目标峰，如果已经用了最佳退火温度，这说明引物设计有问题。
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wl554520877
5楼2013-01-15 08:59:51
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普通回帖

wl554520877

铁虫 (初入文坛)
另外一种图关于ntc的是附件一，传图片传漏了
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
2楼2013-01-14 21:08:04
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hubinghello at 2013-01-14 22:23:03
同求！我曾经扩增效率到800%，问题还没解决。觉得是引物问题。

那么巧你也果树学？你用的是哪个公司的试剂还有仪器呢？
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
4楼2013-01-15 08:38:18
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hubinghello

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wl554520877 at 2013-01-15 08:38:18
那么巧你也果树学？你用的是哪个公司的试剂还有仪器呢？...


伯乐的机子，TOYOBO的mix
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去爱吧，像不曾爱过一样；跳舞吧，像没有人观看一样；唱歌吧，像没有人聆听一样；生活吧，像每天都是世界末日一样；赚钱吧，像不是为了钱一样。
6楼2013-01-15 10:44:51
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hubinghello

金虫 (小有名气)
我设计引物时选择有限，可能是非特异性扩增太严重。庆幸的是这个基因不重要我就没有再搞。
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去爱吧，像不曾爱过一样；跳舞吧，像没有人观看一样；唱歌吧，像没有人聆听一样；生活吧，像每天都是世界末日一样；赚钱吧，像不是为了钱一样。
7楼2013-01-15 10:51:07
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hubinghello at 2013-01-15 10:51:07
我设计引物时选择有限，可能是非特异性扩增太严重。庆幸的是这个基因不重要我就没有再搞。

我是宝生物的试剂 也是用的伯乐的机子，我没你那么幸运了，这是我毕业论文的一个重要部分，大神们怎么还不来啊！
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
8楼2013-01-15 13:07:10
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hubinghello

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wl554520877 at 2013-01-15 13:07:10
我是宝生物的试剂 也是用的伯乐的机子，我没你那么幸运了，这是我毕业论文的一个重要部分，大神们怎么还不来啊！...

重新筛选引物先？设计夸内含子引物，利用UTR区域神马的。
敢问你是哪个学校的果树？
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去爱吧，像不曾爱过一样；跳舞吧，像没有人观看一样；唱歌吧，像没有人聆听一样；生活吧，像每天都是世界末日一样；赚钱吧，像不是为了钱一样。
9楼2013-01-15 15:02:56
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-15 08:59:51
扩增效率高一般是说明有非特异性扩增或者有引物二聚体。
如果有引物二聚体，熔解曲线上会有比产物温度低的峰出现。一般的正常产物熔解温度高于80°C，引物二聚体的熔解温度会比较低，一般是七十多度。虽然你说熔解 ...

谢谢朋友，早上来看过帖子一拉没看到你的回复，抱歉！抱歉！引物用的是0.5uM，可以再调低点，试剂盒用的是0.4uM，退火温度我做了筛选跑出的结果都是扩增效率很高就没拿上来讨论，另外你讲的负对照没目标峰，我没加模版就应该是没有目标峰的吧。还有引物设计的问题我是用别人做过的，他做就可以，但这一直做不好我就开始有点质疑了，苦于水平太低，连引物我也不晓得怎么设计算好！苦闷，求讲解！
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
10楼2013-01-15 16:36:29
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