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wl554520877

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 求高人指点qpcr问题，扩增效率太高！

最近做荧光定量，问题重重，先是跑了个内参试试，做个标曲，结果出来了，扩增效率很高，达到200%，不过溶解曲线却是单一峰；还有就是ntc也有值，搞不明白，跑了个胶发现有条带应该是引物二聚体吧，我新手也不确定。上图吧，求分析，求帮助！
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2013-01-14 21:04:51, 131.92 K

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只为毕业！没出息吧，呵呵~~

1楼2013-01-14 21:05:07

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

扩增效率高一般是说明有非特异性扩增或者有引物二聚体。
如果有引物二聚体，熔解曲线上会有比产物温度低的峰出现。一般的正常产物熔解温度高于80°C，引物二聚体的熔解温度会比较低，一般是七十多度。虽然你说熔解曲线是单一的峰，但在我看来，在70-80°C之间有两个不明显的小峰，从左边的图也能看出有三处slop的变化。温度低的小峰在负对照中明显放大。只有高于84°C的那个是正常产物。这个图已经很明显的表示扩增不特异。从跑的胶的图上看，似乎有引物二聚体和单体，也可能是非特异产物。你的PCR体系中引物的浓度用的是多少？是不是太高了。此外，你是否对引物做了温度梯度确定最佳退火温度。
你的负对照扩增产物的熔解曲线明显只有温度低的峰，没有目标峰，如果已经用了最佳退火温度，这说明引物设计有问题。