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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求高人指点qpcr问题，扩增效率太高！
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by hubinghello at 2013-01-15 15:02:56
重新筛选引物先？设计夸内含子引物，利用UTR区域神马的。
敢问你是哪个学校的果树？...

学校不提了吧，反正水平很有限就是了，来这里学东西！呵呵~~
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
11楼2013-01-15 16:37:16
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hubinghello

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by wl554520877 at 2013-01-15 16:37:16
学校不提了吧，反正水平很有限就是了，来这里学东西！呵呵~~...

额，不用在意
回复此楼
去爱吧，像不曾爱过一样；跳舞吧，像没有人观看一样；唱歌吧，像没有人聆听一样；生活吧，像每天都是世界末日一样；赚钱吧，像不是为了钱一样。
12楼2013-01-15 16:51:56
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wl554520877

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by hubinghello at 2013-01-15 16:51:56
额，不用在意...

哎，谁来拯救我的实验啊！！！！！
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只为毕业！没出息吧，呵呵~~
13楼2013-01-15 17:50:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by wl554520877 at 2013-01-15 16:36:29
谢谢朋友，早上来看过帖子一拉没看到你的回复，抱歉！抱歉！引物用的是0.5uM，可以再调低点，试剂盒用的是0.4uM，退火温度我做了筛选跑出的结果都是扩增效率很高就没拿上来讨论，另外你讲的负对照没目标峰， ...

引物浓度做q-PCR时一般可以用0.2-0.3uM就可以了，可以减少二聚体形成。
我说负对照没有目标峰的意思是说很可能你的前面的那些小峰是引物二聚体或者非特异扩增造成的，不是反转录的模板有DNA残留。
引物设计其实也不难，主要是考虑引物的特异性。这一点很重要，必须只P出目标基因。你可以通过各种软件衡量是否形成复杂二级结构。同时注意引物对不形成异源二聚体。如果做Q-PCR，要比较的基因和内参扩增出的片段大小最好大致相同，并且引物对的退火温度也是差不多，退火温度最好高于60度。如果是真核生物，有可能的话引物跨越内含子。
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14楼2013-01-16 09:06:56
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
跟上面的兄弟反应的结论基本一致：你的产物不特异，出现了非特异性扩增，引物需要重新设计。
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好好学习，天天向上
15楼2013-01-17 17:16:16
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