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wl554520877

铁虫 (初入文坛)

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专业: 果树学

[求助] 求高人指点qpcr问题，扩增效率太高！

最近做荧光定量，问题重重，先是跑了个内参试试，做个标曲，结果出来了，扩增效率很高，达到200%，不过溶解曲线却是单一峰；还有就是ntc也有值，搞不明白，跑了个胶发现有条带应该是引物二聚体吧，我新手也不确定。上图吧，求分析，求帮助！
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2013-01-14 21:04:51, 131.92 K

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只为毕业！没出息吧，呵呵~~

1楼 2013-01-14 21:05:07

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

MolEPI: 10
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【答案】应助回帖

引用回帖:

10楼: Originally posted by wl554520877 at 2013-01-15 16:36:29

谢谢朋友，早上来看过帖子一拉没看到你的回复，抱歉！抱歉！引物用的是0.5uM，可以再调低点，试剂盒用的是0.4uM，退火温度我做了筛选跑出的结果都是扩增效率很高就没拿上来讨论，另外你讲的负对照没目标峰， ...

引物浓度做q-PCR时一般可以用0.2-0.3uM就可以了，可以减少二聚体形成。
我说负对照没有目标峰的意思是说很可能你的前面的那些小峰是引物二聚体或者非特异扩增造成的，不是反转录的模板有DNA残留。
引物设计其实也不难，主要是考虑引物的特异性。这一点很重要，必须只P出目标基因。你可以通过各种软件衡量是否形成复杂二级结构。同时注意引物对不形成异源二聚体。如果做Q-PCR，要比较的基因和内参扩增出的片段大小最好大致相同，并且引物对的退火温度也是差不多，退火温度最好高于60度。如果是真核生物，有可能的话引物跨越内含子。