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imyting至尊木虫 (正式写手)
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小肽电泳低于5KD的小肽看不到条带
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| 本人正在做的小肽是2.5KD,使用的是中科瑞泰生物公司的超低蛋白maker，其中3.5和1.4KD 的条带看不见。不知道是什么原因，求小肽电泳达人指教。 |
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imyting
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我的电泳就是按照这个说明书做的，希望大家帮忙看看有什么可以改进的地方: 超低分子量蛋白质Marker II（1.4-26.6kD） Ultra Low Molecular Weight Protein Marker II ●产品编号及规格： RTD6107 10T（100μl） ● 储存条件： -20℃保存，开封后有效期12个月。 ● 产品简介： 本产品包含2种多肽和4种低分子量蛋白质组成，可以用来判断 SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。分子量范围为1.4kD-26.6kD，分子量大小为1.4kD，3.5kD，6.5kD，14.2kD，16.9kD，26.6kD。 ● 使用说明： 1. 超低分子量多肽的蛋白电泳较常规的蛋白电泳更为复杂，请仔细参阅说明书后再进行操作。 2. 收到产品后，室温彻底融化混匀后，离心快甩将溶液收集到管底，根据需要适量分装，-20℃贮存，每次使用时取一管使用。 3. 本产品已经含有了样品缓冲液，使用前取一管Marker样品室温彻底融化后，95℃预热5分钟即可上样电泳，用考马斯亮蓝G-250染色后可见6条蛋白带。一般说来，0.75mm×5mm（厚度×宽度）的加样孔上样10μl，其他规格梳子请适当调整上样量。 注：一次热处理后，未用尽样品-20℃保存；下次使用时只要室温完全融化混匀后即可上样，可以不用再加热处理。 4. 制胶：先配制分离胶，聚合后再配制浓缩胶。电泳时，80-100v跑30-60分钟左右，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至150-200v，至蓝色指示前沿至分离胶3/4位置时即可停止电泳。整个电泳过程大约需要3-4个小时。注：如果电泳时间过短，染色时，指示前沿容易遮挡1.4kD和3.5kD条带。 5. 如果关心较小的多肽（小于5KD），电泳之后可将胶置于固定液中固定30分钟，再进行染色，能得到较好的蛋白条带；如果不固定直接染色，小蛋白会不清楚。如果使用配方7进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择本公司的考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液（目录号：RTD6201），该产品具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，在小肽的染色中有更大的优势，是常规染色液的理想替代品。 6. 当用配方7进行染色时，由于超低分子量多肽极易从凝胶中浸出，因此染色时间不要太长，染色一般要1个小时左右（最多不要超过1.5小时）。 （背面续：凝胶配方） ● 附：小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制 1. 40%PAA（29:1）（配制浓缩胶） 丙稀酰胺 38.67 g 甲叉双丙稀酰胺 1.33 g 用ddH2O溶解后定容至100 ml，过滤后使用。 贮存：4℃ 2. 40% PAA（19:1） （配制分离胶） 丙稀酰胺 38 g 甲叉双丙稀酰胺 2 g 用ddH2O溶解后定容至100 ml，过滤后使用。 贮存：4℃ 3. 凝胶缓冲液（配制凝胶用） [3M Tris; 0.3% SDS; pH8.45] Tris碱 182g ddH2O 300ml 1.5 g SDS或15ml 10％ SDS 用HCl调pH值至8.45 用ddH2O定容至500ml 贮存：4℃ 4. 10×阳极缓冲液（下槽缓冲液） [1M Tris pH8.9] Tris碱 121.1g ddH2O 400ml 用HCl调pH值至8.9 用ddH2O定容至500ml 贮存：4℃ 注：使用前稀释成1×阳极缓冲液使用。 5. 10×阴极缓冲液（上槽缓冲液） [1M Tris; 1M Tricine ;1% SDS; pH 8.25] Tris碱 121.14 g Tricine 179.2 g SDS 10g 用ddH2O溶解， 用HCl调节pH至8.25，定容至1000ml。 贮存：4℃ 注：使用前稀释成1×阴极缓冲液使用 6. 固定液 5％ 戊二醛溶液 注：此溶液现用现配。 7. 染色液 冰醋酸 100ml 考马斯亮蓝G-250 0.25g 水 900ml 8. 脱色液 冰醋酸 100ml 水 900ml 9. 2×Tricine蛋白样品上样缓冲液（10ml） 1ml 1M Tris-Cl pH6.8 2.4ml 甘油 0.8g SDS 0.31g DTT（或者400μl β-巯基乙醇） 2mg 考马斯亮蓝G-250 用灭菌ddH2O定容至10ml 混匀分装-20℃贮存备用 超低分子量蛋白Marker凝胶的配制方法： （一块0.75mm mini胶用量） 分离胶 浓缩胶 18％T, 5%C /6.0 ml 5％T, 3.3%C/4 ml 40% PAA（19:1） 2.7 ml / 40% PAA (29:1) / 0.5 ml 凝胶缓冲液 1.5 ml 1 ml 乙二醇（电泳级） 1.8 ml / ddH2O / 2.5 ml 10％APS 45 μl 30 μl TEMED 9 μl 6 μl 超低分子量蛋白Marker 配套试剂 名称 货号 规格 贮存 超低分子量蛋白Marker I（3.3-20.1kD） RTD6101 10次（100μl） -20℃ 超低分子量蛋白Marker II（1.4-26.6kD） RTD6107 10次（100μl） -20℃ 彩虹预染超低分子量蛋白Marker（1.2-45kD） RTD6110 10次 （50μl） -20℃ 40% PAA（19:1） AC1914 100ml 4℃ 40% PAA（29:1） AC2914 100ml 4℃ 凝胶缓冲液 GB010 100ml 4℃ 灭菌水 DE005 100ml 室温 10% APS AP020 5×1ml -20℃ TEMED TE040 10ml 室温 10×阳极缓冲液 AB080 100ml 4℃ 10×阴极缓冲液 CB010 100ml 4℃ 2×Tricine 上样缓冲液 TP050 5×1ml -20℃ 考马斯亮蓝快速染色液 RTD6201 500ml 4℃ 乙二醇 EA0582 25ml 室温 50%戊二醛 AM155 50ml 4℃ |
7楼2013-01-07 14:34:57
cicelyzh
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