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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 小肽电泳低于5KD的小肽看不到条带
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 小肽电泳低于5KD的小肽看不到条带

本人正在做的小肽是2.5KD,使用的是中科瑞泰生物公司的超低蛋白maker，其中3.5和1.4KD 的条带看不见。不知道是什么原因，求小肽电泳达人指教。
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1楼2013-01-06 21:35:56
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imyting

至尊木虫 (正式写手)
★ ★ ★
imyting: 回帖置顶 2013-01-07 18:06:22
wizardfan: 金币+3, 谢谢补充信息，以后记得开帖的时候提供尽可能多的信息，以更快的获得帮助 2013-01-17 04:00:43
我的电泳就是按照这个说明书做的，希望大家帮忙看看有什么可以改进的地方:









超低分子量蛋白质Marker II（1.4-26.6kD）
Ultra Low Molecular Weight Protein Marker II

●产品编号及规格：
RTD6107   10T（100μl） ● 储存条件：    -20℃保存，开封后有效期12个月。 ● 产品简介：     本产品包含2种多肽和4种低分子量蛋白质组成，可以用来判断 SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。分子量范围为1.4kD-26.6kD，分子量大小为1.4kD，3.5kD，6.5kD，14.2kD，16.9kD，26.6kD。
● 使用说明： 1. 超低分子量多肽的蛋白电泳较常规的蛋白电泳更为复杂，请仔细参阅说明书后再进行操作。
2. 收到产品后，室温彻底融化混匀后，离心快甩将溶液收集到管底，根据需要适量分装，-20℃贮存，每次使用时取一管使用。
3. 本产品已经含有了样品缓冲液，使用前取一管Marker样品室温彻底融化后，95℃预热5分钟即可上样电泳，用考马斯亮蓝G-250染色后可见6条蛋白带。一般说来，0.75mm×5mm（厚度×宽度）的加样孔上样10μl，其他规格梳子请适当调整上样量。 注：一次热处理后，未用尽样品-20℃保存；下次使用时只要室温完全融化混匀后即可上样，可以不用再加热处理。
4. 制胶：先配制分离胶，聚合后再配制浓缩胶。电泳时，80-100v跑30-60分钟左右，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至150-200v，至蓝色指示前沿至分离胶3/4位置时即可停止电泳。整个电泳过程大约需要3-4个小时。注：如果电泳时间过短，染色时，指示前沿容易遮挡1.4kD和3.5kD条带。
5. 如果关心较小的多肽（小于5KD），电泳之后可将胶置于固定液中固定30分钟，再进行染色，能得到较好的蛋白条带；如果不固定直接染色，小蛋白会不清楚。如果使用配方7进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择本公司的考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液（目录号：RTD6201），该产品具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，在小肽的染色中有更大的优势，是常规染色液的理想替代品。
6. 当用配方7进行染色时，由于超低分子量多肽极易从凝胶中浸出，因此染色时间不要太长，染色一般要1个小时左右（最多不要超过1.5小时）。                      （背面续：凝胶配方）

● 附：小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制
1. 40%PAA（29:1）（配制浓缩胶）     
   丙稀酰胺        38.67 g     甲叉双丙稀酰胺  1.33 g
用ddH2O溶解后定容至100 ml，过滤后使用。
贮存：4℃        2.  40% PAA（19:1） （配制分离胶）
丙稀酰胺       38 g
甲叉双丙稀酰胺  2 g
用ddH2O溶解后定容至100 ml，过滤后使用。
贮存：4℃        3. 凝胶缓冲液（配制凝胶用）
[3M Tris; 0.3% SDS; pH8.45]
Tris碱  182g
ddH2O   300ml
1.5 g SDS或15ml 10％ SDS
用HCl调pH值至8.45
用ddH2O定容至500ml
贮存：4℃
4. 10×阳极缓冲液（下槽缓冲液）
[1M Tris pH8.9]
Tris碱    121.1g
ddH2O   400ml
用HCl调pH值至8.9
用ddH2O定容至500ml
贮存：4℃
注：使用前稀释成1×阳极缓冲液使用。        5. 10×阴极缓冲液（上槽缓冲液）
[1M Tris; 1M Tricine ;1% SDS; pH 8.25]
Tris碱 121.14 g
Tricine  179.2 g
SDS 10g
用ddH2O溶解，
用HCl调节pH至8.25，定容至1000ml。
贮存：4℃
注：使用前稀释成1×阴极缓冲液使用        6. 固定液
5％ 戊二醛溶液
注：此溶液现用现配。
7. 染色液
冰醋酸            100ml
考马斯亮蓝G-250   0.25g
水                900ml        8. 脱色液
冰醋酸  100ml
水      900ml
        9.  2×Tricine蛋白样品上样缓冲液（10ml）
1ml  1M Tris-Cl pH6.8
2.4ml 甘油
0.8g  SDS
0.31g DTT（或者400μl β-巯基乙醇）
2mg 考马斯亮蓝G-250
用灭菌ddH2O定容至10ml
混匀分装-20℃贮存备用

超低分子量蛋白Marker凝胶的配制方法：
（一块0.75mm mini胶用量）
        分离胶        浓缩胶
        18％T, 5%C /6.0 ml        5％T, 3.3%C/4 ml
40% PAA（19:1）        2.7 ml        /
40% PAA (29:1)        /        0.5 ml
凝胶缓冲液        1.5 ml        1 ml
乙二醇（电泳级）        1.8 ml        /
ddH2O        /        2.5 ml
10％APS        45 μl        30 μl
TEMED        9 μl        6 μl





超低分子量蛋白Marker 配套试剂

名称        货号        规格        贮存
超低分子量蛋白Marker I（3.3-20.1kD）        RTD6101        10次（100μl）        -20℃
超低分子量蛋白Marker II（1.4-26.6kD）        RTD6107        10次（100μl）        -20℃
彩虹预染超低分子量蛋白Marker（1.2-45kD）        RTD6110        10次 （50μl）        -20℃
40% PAA（19:1）        AC1914        100ml        4℃
40% PAA（29:1）        AC2914        100ml        4℃
凝胶缓冲液        GB010        100ml        4℃
灭菌水        DE005        100ml        室温
10% APS        AP020        5×1ml        -20℃
TEMED        TE040        10ml        室温
10×阳极缓冲液        AB080        100ml        4℃
10×阴极缓冲液        CB010        100ml        4℃
2×Tricine 上样缓冲液        TP050        5×1ml        -20℃
考马斯亮蓝快速染色液        RTD6201        500ml        4℃
乙二醇        EA0582        25ml        室温
50%戊二醛        AM155        50ml        4℃
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
7楼2013-01-07 14:34:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
imyting: 金币+5, ★★★很有帮助, 是的，有什么需要注意的吗？ 2013-01-07 14:15:45
是用Tricine胶跑的吗？普通的SDS胶在那么小的区域分辨率很低，是看不到带的。
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2楼2013-01-07 03:08:26
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javadig

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
imyting: 金币+5, ★★★很有帮助, 18%的分离胶，tricine，全都是按照maker说明书上操作的 2013-01-07 14:16:56
什么样的胶？这个和胶关系很大。起码marker要跑出来的。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-01-07 07:17:27
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shaohuiwu007

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
imyting: 金币+10, 我是用两层胶跑的，不知道你用三层胶能跑出的最小条带是多少 2013-01-07 14:17:50
我以前做过，可以跑出的，用三层胶就可以了。
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知识属于整个人类，大家一起分享，共同促进人类的发展。
4楼2013-01-07 11:36:21
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xiaojun542

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
imyting: 金币+2, ★有帮助, 前面已经说过，这个我很注意，溴酚蓝还有1cm左右就停了，所以不会跑出去的 2013-01-08 08:58:10
wizardfan: 应助指数-1, 楼主7号的时候已经回复过这个问题了，不能算应助 2013-01-17 04:02:46
有可能是低于5kd的小肽已经跑出去了
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10楼2013-01-08 08:43:11
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conanzzz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

imyting: 金币+58, ★★★很有帮助, 我现在的问题是看不见最后两条MAKER 2013-01-08 09:21:40
yqbter: 金币-40, 楼主操作失误，要求退还金币！ 2013-01-08 11:38:38
yqbter: 金币-18, 楼主操作失误，要求退还金币！ 2013-01-08 11:39:07
供参考，因为18%的胶浓度比较大，感觉4-5H还不够
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13楼2013-01-08 09:16:12
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conanzzz

木虫 (正式写手)
你可以先试下16.5%的胶，看Marker能不能跑出来；有条件的话最好控制在低温电泳；另外谢谢你的金币~~
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14楼2013-01-08 10:00:21
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genda_cto

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

能附一张结果图上来吗？有可能是你电泳的时间不够，1.4kD，3.5kD，6.5kD的条带没分开。也有可能是胶浓度不够。根据前面已经显示出来的带，算出电泳迁移率，估算小肽条带所应该在的位置，来判断是否marker已经降解以及胶浓度是否使用。如果证实了marker没有降解，那就增大胶浓度增大电泳时间试试。注意溴酚蓝指示带并不是电泳中跑得最快的带！
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16楼2013-01-10 13:47:32
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普通回帖

conanzzz

木虫 (正式写手)
染色方法?银染?
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5楼2013-01-07 12:15:02
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imyting

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by conanzzz at 2013-01-07 12:15:02
染色方法?银染?

可以试试看
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
6楼2013-01-07 14:18:01
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
imyting: 金币+5, ★★★很有帮助, 可以试一试 2013-01-07 18:04:55
一般的tricine电泳就可以跑出来啊！
跑电泳的时候，最好控制一下电压，尽量慢的进行电泳！
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8楼2013-01-07 14:58:39
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legend811

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
imyting: 金币+3, ★有帮助, 这个我有注意，不会跑出去的 2013-01-07 18:05:33
本帖内容被屏蔽
9楼2013-01-07 15:24:26
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