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imyting

至尊木虫 (正式写手)

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[求助] 小肽电泳低于5KD的小肽看不到条带

本人正在做的小肽是2.5KD,使用的是中科瑞泰生物公司的超低蛋白maker，其中3.5和1.4KD 的条带看不见。不知道是什么原因，求小肽电泳达人指教。

回复此楼

悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便

1楼2013-01-06 21:35:56

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imyting

至尊木虫 (正式写手)

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★ ★ ★
imyting: 回帖置顶 2013-01-07 18:06:22
wizardfan: 金币+3, 谢谢补充信息，以后记得开帖的时候提供尽可能多的信息，以更快的获得帮助 2013-01-17 04:00:43

我的电泳就是按照这个说明书做的，希望大家帮忙看看有什么可以改进的地方:

超低分子量蛋白质Marker II（1.4-26.6kD）
Ultra Low Molecular Weight Protein Marker II

●产品编号及规格：
RTD6107 10T（100μl） ● 储存条件： -20℃保存，开封后有效期12个月。 ● 产品简介：    本产品包含2种多肽和4种低分子量蛋白质组成，可以用来判断 SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。分子量范围为1.4kD-26.6kD，分子量大小为1.4kD，3.5kD，6.5kD，14.2kD，16.9kD，26.6kD。
● 使用说明： 1. 超低分子量多肽的蛋白电泳较常规的蛋白电泳更为复杂，请仔细参阅说明书后再进行操作。
2. 收到产品后，室温彻底融化混匀后，离心快甩将溶液收集到管底，根据需要适量分装，-20℃贮存，每次使用时取一管使用。
3. 本产品已经含有了样品缓冲液，使用前取一管Marker样品室温彻底融化后，95℃预热5分钟即可上样电泳，用考马斯亮蓝G-250染色后可见6条蛋白带。一般说来，0.75mm×5mm（厚度×宽度）的加样孔上样10μl，其他规格梳子请适当调整上样量。注：一次热处理后，未用尽样品-20℃保存；下次使用时只要室温完全融化混匀后即可上样，可以不用再加热处理。
4. 制胶：先配制分离胶，聚合后再配制浓缩胶。电泳时，80-100v跑30-60分钟左右，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至150-200v，至蓝色指示前沿至分离胶3/4位置时即可停止电泳。整个电泳过程大约需要3-4个小时。注：如果电泳时间过短，染色时，指示前沿容易遮挡1.4kD和3.5kD条带。
5. 如果关心较小的多肽（小于5KD），电泳之后可将胶置于固定液中固定30分钟，再进行染色，能得到较好的蛋白条带；如果不固定直接染色，小蛋白会不清楚。如果使用配方7进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择本公司的考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液（目录号：RTD6201），该产品具有染色快，无毒，灵敏性高等特点，在小肽的染色中有更大的优势，是常规染色液的理想替代品。
6. 当用配方7进行染色时，由于超低分子量多肽极易从凝胶中浸出，因此染色时间不要太长，染色一般要1个小时左右（最多不要超过1.5小时）。                   （背面续：凝胶配方）

● 附：小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制
1. 40%PAA（29:1）（配制浓缩胶）
丙稀酰胺       38.67 g    甲叉双丙稀酰胺  1.33 g
用ddH2O溶解后定容至100 ml，过滤后使用。
贮存：4℃ 2.  40% PAA（19:1）（配制分离胶）
丙稀酰胺    38 g
甲叉双丙稀酰胺  2 g
用ddH2O溶解后定容至100 ml，过滤后使用。
贮存：4℃ 3. 凝胶缓冲液（配制凝胶用）
[3M Tris; 0.3% SDS; pH8.45]
Tris碱  182g
ddH2O 300ml
1.5 g SDS或15ml 10％ SDS
用HCl调pH值至8.45
用ddH2O定容至500ml
贮存：4℃
4. 10×阳极缓冲液（下槽缓冲液）
[1M Tris pH8.9]
Tris碱 121.1g
ddH2O 400ml
用HCl调pH值至8.9
用ddH2O定容至500ml
贮存：4℃
注：使用前稀释成1×阳极缓冲液使用。 5. 10×阴极缓冲液（上槽缓冲液）
[1M Tris; 1M Tricine ;1% SDS; pH 8.25]
Tris碱 121.14 g
Tricine  179.2 g
SDS 10g
用ddH2O溶解，
用HCl调节pH至8.25，定容至1000ml。
贮存：4℃
注：使用前稀释成1×阴极缓冲液使用 6. 固定液
5％戊二醛溶液
注：此溶液现用现配。
7. 染色液
冰醋酸          100ml
考马斯亮蓝G-250 0.25g
水             900ml 8. 脱色液
冰醋酸  100ml
水    900ml
9.  2×Tricine蛋白样品上样缓冲液（10ml）
1ml  1M Tris-Cl pH6.8
2.4ml 甘油
0.8g  SDS
0.31g DTT（或者400μl β-巯基乙醇）
2mg 考马斯亮蓝G-250
用灭菌ddH2O定容至10ml
混匀分装-20℃贮存备用

超低分子量蛋白Marker凝胶的配制方法：
（一块0.75mm mini胶用量）
分离胶浓缩胶
18％T, 5%C /6.0 ml 5％T, 3.3%C/4 ml
40% PAA（19:1） 2.7 ml /
40% PAA (29:1) / 0.5 ml
凝胶缓冲液 1.5 ml 1 ml
乙二醇（电泳级） 1.8 ml /
ddH2O / 2.5 ml
10％APS 45 μl 30 μl
TEMED 9 μl 6 μl

超低分子量蛋白Marker 配套试剂

名称货号规格贮存
超低分子量蛋白Marker I（3.3-20.1kD） RTD6101 10次（100μl） -20℃
超低分子量蛋白Marker II（1.4-26.6kD） RTD6107 10次（100μl） -20℃
彩虹预染超低分子量蛋白Marker（1.2-45kD） RTD6110 10次（50μl） -20℃
40% PAA（19:1） AC1914 100ml 4℃
40% PAA（29:1） AC2914 100ml 4℃
凝胶缓冲液 GB010 100ml 4℃
灭菌水 DE005 100ml 室温
10% APS AP020 5×1ml -20℃
TEMED TE040 10ml 室温
10×阳极缓冲液 AB080 100ml 4℃
10×阴极缓冲液 CB010 100ml 4℃
2×Tricine 上样缓冲液 TP050 5×1ml -20℃
考马斯亮蓝快速染色液 RTD6201 500ml 4℃
乙二醇 EA0582 25ml 室温
50%戊二醛 AM155 50ml 4℃