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zhangxiashin

新虫 (初入文坛)

[交流] 基因全长及表达 已有1人参与

亲们，目前得到某蛋白基因的两个片段，一个是1-1300，另外一个是1200-1800，请问如何用重叠pcr连接在一起，从而获取全长呢，求具体的指点。
得到全长（从ATG到3’末端）后必须做5‘RACE吗才能进行表达吗？我目的是能表达出有酶活性的蛋白，谢谢亲们
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1楼 2013-01-05 09:33:58
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moqiyilei

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用全长设计引物，把1-1300  1200-1800两段分别扩增后做模板，然后PCR就OK了。
得到CDS后没必要做5'RACE,表达蛋白用CDS足够了。
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2楼2013-01-05 09:41:47
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zhangxiashin

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by moqiyilei at 2013-01-05 09:41:47
用全长设计引物，把1-1300  1200-1800两段分别扩增后做模板，然后PCR就OK了。
得到CDS后没必要做5'RACE,表达蛋白用CDS足够了。

谢谢亲，我现在是提取真菌的RNA，逆转录成cDNA，以此为模板进行PCR扩增，然后进行测序，我现在得到的是从ATG到TAA的一个序列，我得到的序列就是CDS了吧？
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3楼2013-01-05 10:52:29
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zhangxiashin

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by moqiyilei at 2013-01-05 09:41:47
用全长设计引物，把1-1300  1200-1800两段分别扩增后做模板，然后PCR就OK了。
得到CDS后没必要做5'RACE,表达蛋白用CDS足够了。

关于重叠pcr，需要设分别设计A好B两个片段的首尾引物吗？A片段的下游引物和B片段的上游引物需要有重叠部分吗？如果是这样的话，貌似很难复杂的样子……
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4楼2013-01-05 10:54:40
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moqiyilei

金虫 (小有名气)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-07 16:32:26
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4楼: Originally posted by zhangxiashin at 2013-01-05 10:54:40
关于重叠pcr，需要设分别设计A好B两个片段的首尾引物吗？A片段的下游引物和B片段的上游引物需要有重叠部分吗？如果是这样的话，貌似很难复杂的样子……...

你的真菌基因组测序了吗?如果测序了，直接在基因组数据库中找cds，如果没测序，需要以你这段ORF为基础，进行5‘RACE  3’RACE,确定再找不出更大ORF,如此，你找到的ORF才是CDS.
  关于overlap pcr，A下游与B上后引物没必要有重叠部分，但是A与B一定要有20bp以上overlap，这样再用CDS全长设计引物扩增便可。
  希望对你有用。
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5楼2013-01-07 13:21:35
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zhangxiashin

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by moqiyilei at 2013-01-07 13:21:35
你的真菌基因组测序了吗?如果测序了，直接在基因组数据库中找cds，如果没测序，需要以你这段ORF为基础，进行5‘RACE  3’RACE,确定再找不出更大ORF,如此，你找到的ORF才是CDS.
  关于overlap pcr，A下游与B上后引 ...

谢谢你耐心的指点，我的真菌基因组没有测序，所以做5‘RACE是必须的了吧？看了好多帖子，5’RACE很难做的样子。根据和其他菌株中该酶基因的比对，几乎可以确定是到5‘端的ATG了，前面的非编码区对我的表达影响很大吗？万一我5’RACE失败了，我可以直接尝试表达吗？
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6楼2013-01-07 16:32:30
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zhangxiashin

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by moqiyilei at 2013-01-07 13:21:35
你的真菌基因组测序了吗?如果测序了，直接在基因组数据库中找cds，如果没测序，需要以你这段ORF为基础，进行5‘RACE  3’RACE,确定再找不出更大ORF,如此，你找到的ORF才是CDS.
  关于overlap pcr，A下游与B上后引 ...

我个人觉得我得到的ATG前面就是5‘端的非编码区了，因为我是根据ncbi中其他真菌中该基因的序列ATG开始设计引物，去调我的基因的。不知道我的理解是否正确
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7楼2013-01-07 16:37:38
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moqiyilei

金虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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7楼: Originally posted by zhangxiashin at 2013-01-07 16:37:38
我个人觉得我得到的ATG前面就是5‘端的非编码区了，因为我是根据ncbi中其他真菌中该基因的序列ATG开始设计引物，去调我的基因的。不知道我的理解是否正确...

你觉得是没用,最好RACE一下,再者,5'race不难做,华南农大刘耀光有一篇关于高效tail pcr的文章,里面有他设计好的所有物种都通用的引物,然后你再按照你已知的序列设计反向引物RACE就可以了.
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8楼2013-01-10 11:15:53
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