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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DNA测序问题
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jasminezhao

金虫 (小有名气)

[求助] DNA测序问题

最近在做重组子的构建，可是做完转化后，提取的质粒为什么浓度很低只有几十ng/ui，这个是什么原因跟跳的单克隆菌落的大小有关系吗？还有就是送去测序为什么得到的序列结果非常少只有三四百个bp，这是什么原因？希望大家能给宝贵意见，都做了三四个月了还是无结果，真的急疯了，谢谢各位了！！
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1楼 2013-01-04 20:50:11
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xingxingsf

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:38:24
做完转化的平板上长出的菌落是很小，所以要先划到新的平板上养一夜，长多点再提质粒，理论上即使挑很小的菌落在液体LB培养基里养一夜也能长到10的9次方左右了，足够提质粒了。你很少的原因可能是转化效率低，重组质粒没转进去？
测序一个反应就400bp左右，你的片段长的话可以要求公司测通，再拼接起来就行了。
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2楼2013-01-04 21:13:43
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
浓度和你的质粒毒性/复制位点有关，低copy质粒就几十ng/ul，不过也够用了。

测序300-400是不是符合你预期的序列？ 这个和质粒质量（杂质）/测序引物/质粒多少有关
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3楼2013-01-05 03:42:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:38:36
你用的手提质粒还是盒子提？如果的低拷贝质粒，盒子提就是几十ng/ul。如果希望浓度高就多摇些菌。挑很小的克隆摇菌过夜提质粒也足够的。
高质量的测序一个反应可以读600-700nt，但是后面的分辨率也不是很好，400nt是正常的。当然，如果模板质量高，测序出来的结果会更漂亮，读出来的也稍微长一点。但也不会超过我说的那个数目了。如果你的序列长，需要多个引物测，再把序列拼接起来。
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4楼2013-01-05 08:57:31
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jasminezhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xingxingsf at 2013-01-04 21:13:43
做完转化的平板上长出的菌落是很小，所以要先划到新的平板上养一夜，长多点再提质粒，理论上即使挑很小的菌落在液体LB培养基里养一夜也能长到10的9次方左右了，足够提质粒了。你很少的原因可能是转化效率低，重组质 ...

划到新的平板上长一夜是指挑一个单克隆抗体直接在新的平板上划吗？如果要求测通的话，怎么拼接起来是公司自己就会帮你拼接起来吗？这个之前没弄过，所以不是很了解。还有就是之前做的质粒拿去测序都能得到一千四五百个bp，但是这两回拿去测序的结果得到的都很少！谢谢
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5楼2013-01-05 09:17:20
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jasminezhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-01-05 03:42:48
浓度和你的质粒毒性/复制位点有关，低copy质粒就几十ng/ul，不过也够用了。

测序300-400是不是符合你预期的序列？ 这个和质粒质量（杂质）/测序引物/质粒多少有关

不符合啊，以前拿去测序都能得到一千四五百个bp这两回都得的可少了，我就不知道问题出在哪里了
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6楼2013-01-05 09:18:50
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jasminezhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-05 08:57:31
你用的手提质粒还是盒子提？如果的低拷贝质粒，盒子提就是几十ng/ul。如果希望浓度高就多摇些菌。挑很小的克隆摇菌过夜提质粒也足够的。
高质量的测序一个反应可以读600-700nt，但是后面的分辨率也不是很好，400nt ...

我是用试剂盒提的，以前体的质粒浓度都是四五百，但是这两回都是几十，而且以前测序得到的结果是一千四五百个bp，但是这两回都是三四百个，所以我也不知道哪个是正确的了。求解答，谢谢！！
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7楼2013-01-05 09:23:00
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xingxingsf

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by jasminezhao at 2013-01-05 09:17:20
划到新的平板上长一夜是指挑一个单克隆抗体直接在新的平板上划吗？如果要求测通的话，怎么拼接起来是公司自己就会帮你拼接起来吗？这个之前没弄过，所以不是很了解。还有就是之前做的质粒拿去测序都能得到一千四五 ...

划到新的平板上算是扩增一下菌的数量，也方便你以后保存或者再用，要不只有单菌落提完质粒不就没有了吗?
测通的话公司会帮你拼接起来，只要跟公司的人说一下就可以。
一般的一个测序反应就400bp左右，你之前的如果没要求测通的话有一千多我就不知道了。你可以问问公司的技术人员，他们会比较了解吧。
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8楼2013-01-05 09:45:51
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jasminezhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xingxingsf at 2013-01-05 09:45:51
划到新的平板上算是扩增一下菌的数量，也方便你以后保存或者再用，要不只有单菌落提完质粒不就没有了吗?
测通的话公司会帮你拼接起来，只要跟公司的人说一下就可以。
一般的一个测序反应就400bp左右，你之前的如 ...

恩，知道了谢谢。还有就是拿到序列结果后怎么进行分析啊，我不太会分析事与原序列比对吗？
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9楼2013-01-05 10:03:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:39:00
引用回帖:
7楼: Originally posted by jasminezhao at 2013-01-05 09:23:00
我是用试剂盒提的，以前体的质粒浓度都是四五百，但是这两回都是几十，而且以前测序得到的结果是一千四五百个bp，但是这两回都是三四百个，所以我也不知道哪个是正确的了。求解答，谢谢！！...

是什么载体？不同载体的复制子不一样，拷贝数也不同。此外，是不是抗生素失效了。如果抗生素压力小，质粒的拷贝数也上不去。还有，你的平板在4度放了很久吗？时间久了菌的活力下降，提质粒的时候浓度也上不去。至于测序的结果，1400应该是两个反应，正反两个方向的引物拼接出来的。如果是一个反应不可能读这么长的。你可以仔细检查，是否两个反应的引物都给出了序列。
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10楼2013-01-05 12:44:38
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