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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DNA测序问题
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jasminezhao

金虫 (小有名气)

[求助] DNA测序问题

最近在做重组子的构建，可是做完转化后，提取的质粒为什么浓度很低只有几十ng/ui，这个是什么原因跟跳的单克隆菌落的大小有关系吗？还有就是送去测序为什么得到的序列结果非常少只有三四百个bp，这是什么原因？希望大家能给宝贵意见，都做了三四个月了还是无结果，真的急疯了，谢谢各位了！！
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1楼 2013-01-04 20:50:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:39:00
引用回帖:
7楼: Originally posted by jasminezhao at 2013-01-05 09:23:00
我是用试剂盒提的，以前体的质粒浓度都是四五百，但是这两回都是几十，而且以前测序得到的结果是一千四五百个bp，但是这两回都是三四百个，所以我也不知道哪个是正确的了。求解答，谢谢！！...

是什么载体？不同载体的复制子不一样，拷贝数也不同。此外，是不是抗生素失效了。如果抗生素压力小，质粒的拷贝数也上不去。还有，你的平板在4度放了很久吗？时间久了菌的活力下降，提质粒的时候浓度也上不去。至于测序的结果，1400应该是两个反应，正反两个方向的引物拼接出来的。如果是一个反应不可能读这么长的。你可以仔细检查，是否两个反应的引物都给出了序列。
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10楼2013-01-05 12:44:38
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xingxingsf

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:38:24
做完转化的平板上长出的菌落是很小，所以要先划到新的平板上养一夜，长多点再提质粒，理论上即使挑很小的菌落在液体LB培养基里养一夜也能长到10的9次方左右了，足够提质粒了。你很少的原因可能是转化效率低，重组质粒没转进去？
测序一个反应就400bp左右，你的片段长的话可以要求公司测通，再拼接起来就行了。
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2楼2013-01-04 21:13:43
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
浓度和你的质粒毒性/复制位点有关，低copy质粒就几十ng/ul，不过也够用了。

测序300-400是不是符合你预期的序列？ 这个和质粒质量（杂质）/测序引物/质粒多少有关
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3楼2013-01-05 03:42:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-05 17:38:36
你用的手提质粒还是盒子提？如果的低拷贝质粒，盒子提就是几十ng/ul。如果希望浓度高就多摇些菌。挑很小的克隆摇菌过夜提质粒也足够的。
高质量的测序一个反应可以读600-700nt，但是后面的分辨率也不是很好，400nt是正常的。当然，如果模板质量高，测序出来的结果会更漂亮，读出来的也稍微长一点。但也不会超过我说的那个数目了。如果你的序列长，需要多个引物测，再把序列拼接起来。
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4楼2013-01-05 08:57:31
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