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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的基因的导入
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sunxin2012

铜虫 (小有名气)

[求助] 目的基因的导入

各位前辈，有哪位对转基因十分熟悉的，希望帮忙解决以下问题。
1、目的基因导入受体细胞，有必要带着完整的载体吗？可不可以在构建完整的表达载体之后，进行酶切，使其带有完整的表达框和部分载体进行转化，会不会影响以后的表达？
2、双基因表达载体的构建，能否给个大体步骤？
3、如果转化效率低，原因可能有哪些？
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1楼2012-12-18 20:08:38
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sunxin2012

铜虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-19 09:04:36
如果你要把目的基因放在质粒上表达而不整合到宿主染色体上去的话，必需有完整的表达载体。否则DNA片段进去了也不能进行复制。
转化效率低有很多原因。一个是本身宿主的感受性差。还有可能是宿主有较强活性的未知限 ...

如果是要整合到宿主染色体上呢，可不可以啊？
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6楼2012-12-19 12:03:34
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sunxin2012

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 静安jingan at 2012-12-19 10:38:26
导入受体细胞还是要有完整的载体的，一段很不容易转进去，至于成功的概率还是很大的，十分之七八吧

你的意思是必须是完整的载体吗?不是说片段越大越难转化么
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8楼2012-12-19 12:56:28
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sunxin2012

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2012-12-19 10:11:56
双基因表达载体的构建，没有什么特殊的，只不过其有两个独立的promoter-RBS-MCS系统，构建的时候，做两次连接，方法和单基因表达载体构建是一样的。

谢谢哈
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9楼2012-12-19 12:58:13
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sunxin2012

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-19 12:17:16
如果整合到染色体上的话只需要有两侧的同源序列和表达基因的元件就可以了。可以把酶切后的部分载体导入宿主。...

只是完整的表达框就可以了吧？会不会有什么不好的影响。。。。。。。谢谢您了
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10楼2012-12-19 19:12:37
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sunxin2012

铜虫 (小有名气)
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11楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-20 08:35:14
不知道你你做的是不是通过同源重组。除了表达基因所需的启动子、基因、终止子以外，还需要发生重组的那些元件。此外，不明白你指什么不好的影响。...

我做的只是将外源基因导入细胞，然后观察它所引起的功能和蛋白质的变化。。。。。。不好的影响是指目的基因会不会很容易断裂、丢失。
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12楼2012-12-20 09:02:48
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sunxin2012

铜虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-20 09:06:56
如果想让外源基因稳定，最好整合到染色体上。质粒上必需有筛选压力才会存在，而且由于质粒的拷贝数不是很恒定，表达量也不稳定。如果整合到染色体上的话，应该是相对稳定的。整合后应该不容易断裂丢失。...

谢谢啊
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14楼2012-12-21 08:43:52
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sunxin2012

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by platanus at 2012-12-21 11:53:41
看你通过什么方法导入受体细胞，如果通过电子轰击的话只需要启动子加你的目的片段以及筛选标记基因片段就可以啦！

谢谢哈
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16楼2012-12-22 19:34:48
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sunxin2012

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-20 09:06:56
如果想让外源基因稳定，最好整合到染色体上。质粒上必需有筛选压力才会存在，而且由于质粒的拷贝数不是很恒定，表达量也不稳定。如果整合到染色体上的话，应该是相对稳定的。整合后应该不容易断裂丢失。...

能不能再问你一问题，酶切后的末端不用做任何修饰吗？
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17楼2012-12-23 09:49:58
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sunxin2012

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-23 10:24:45
你指要导入受体的酶切产物？最好把酶失活。...

奥，直接高温失活行么？
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19楼2012-12-23 11:37:04
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