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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计 求助
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

[求助] 引物设计 求助

我的基因是个假基因，pubmed上名为CYP4Z2P，我想P一下它的ＣＤＳ区，谁能帮我设计一下引物，我设计了很多对引物试了很多次都不成功，甚是郁闷！！！
ＣＤＳ去序列为：
４atggagc cctcctggct tcaggaactc atggctcacc ccttcttgct gctgatcctc
61  ctctgcatgt ctctgctgct gtttcaggta atcaggttgt accagaggag gagatggacg
121 atcagagcca tgcacctgtt tcctgcaccc cctgcgcact ggttctatgg ccacaaggag
181 tcttacccag taaaagagtt tgaggtgtat cctgagctga tggaaaaata cccatgtgcc
241 gttcccttgt gggttggacc ctttacgatg ttcttcaata tccatgaccc agactatgtc
301 aagattctcc tgaaaagaca agatcccaaa agtgctgtta gccacaaaat ccttgaatcc
361 tgggttggtc gaggacttgt gaccctggat ggttctaaat ggaaaaagca ccgccagatt
421 gtgaaacctg gcttcaacat cagcattctg aaaatattca tcaccatgat gtctaagagt
481 gttcggatga tgctgaacaa atgggaggaa cacattgccc aaaactcacg tctggagctc
541 tttcaacatg tctccctgat gaccctggac agcatcatga agtgtgcctt cagccaccag
601 ggcagcatcc agttggacag taccctggac tcatacctga aagcagtgtt caaccttagc
661 aaaatctcca accagcgcat gaacaatttt ctacatcaca acgacctggt tttcaaattc
721 agctctcaag gccaaatctt ttctaaattt aaccaagaac ttcatcagtt cacagagaaa
781 gtaatccagg accggaagga gtctcttaag gataagctaa aacaagatac tactcagaaa
841 agacgccagg attttctgga catacttttg agtgccaaaa gtgaaaacac caaagacttc
901 tctgaagcag atctccaagc tgaagtgaaa acgttcatgt ttgcaggaca tgacaccaca
961 actactgcta tctcctggat cttttactgc ttggcaaagt accctgagca tcagcagaga
1021 tgctg

[ Last edited by 1949stone on 2012-10-8 at 07:30 ]
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keepon
1楼 2012-10-07 14:28:16
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-07 17:26:09
楼主用什么作为模板的，是否可以肯定模板没有问题呢
另外，这段CDS序列是固定的话，那么楼主设计的引物其实也就固定了，不用加保护碱基，直接上游引物取原序列前20位左右，下游引物取互补序列后20位左右
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有时候，一句话，可以改变未来
2楼2012-10-07 14:40:43
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天空2011

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-28 17:46:03
想问一下楼主干什么用？用不用加酶切位点？个人感觉还是5端加三个保护碱基的好，要是用酶切位点的话在5端依次为三个保护碱基+酶切位点
+20bp的碱基序列，3端为后20bp碱基的反向互补序列，在其5端加保护碱基和酶切位点
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3楼2012-10-07 15:06:14
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-10-07 14:40:43
楼主用什么作为模板的，是否可以肯定模板没有问题呢
另外，这段CDS序列是固定的话，那么楼主设计的引物其实也就固定了，不用加保护碱基，直接上游引物取原序列前20位左右，下游引物取互补序列后20位左右

对呀，因为我得研究它的功能，所以就像你说那样上下游各取１８到２５位之间的序列就行。用的细胞提取的ＲＮＡ然后逆转录的ｃＤＮＡ为模板呀。。。其实关键是我设计的引物在ＮＣＢＩ里ＢＬＡＳＴ时，不能ＢＬＡＳＴ出来我的目的基因，而是其他的基因。。。因为我这个是假基因，所以和正基因的同源性很高，所以ＢＬＡＳＴ时只能把正基因ＢＬＡＳＴ出来。我的目的基因不能BLAST出来。。郁闷死了。。。
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keepon
4楼2012-10-07 15:15:39
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
阁下。。。我这个每次BLAST时都不能BLAST出我的目的基因啊。。。我想研究的这个基因是个假基因。。。
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keepon
5楼2012-10-07 15:17:28
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-08 14:00:41
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-10-07 15:15:39
对呀，因为我得研究它的功能，所以就像你说那样上下游各取１８到２５位之间的序列就行。用的细胞提取的ＲＮＡ然后逆转录的ｃＤＮＡ为模板呀。。。其实关键是我设计的引物在ＮＣＢＩ里ＢＬＡＳＴ时，不能ＢＬＡＳＴ ...

哦，楼主的意思是你在一楼提供的CDS是所谓的正基因，而你想从模板中P出来的是假基因了，而你的假基因通过BLAST跟这个正基因同源性最高。如此看来的话通过楼主提供的CDS是不容易P出目的基因的，因为目的基因很可能在前段跟末端都与正基因有出入。个人认为，楼主首先要确认模板中是否一定含有目的基因，其次就是根据目的基因的保守序列设计简并引物进行PCR。
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有时候，一句话，可以改变未来
6楼2012-10-08 00:16:15
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-10-08 00:16:15
哦，楼主的意思是你在一楼提供的CDS是所谓的正基因，而你想从模板中P出来的是假基因了，而你的假基因通过BLAST跟这个正基因同源性最高。如此看来的话通过楼主提供的CDS是不容易P出目的基因的，因为目的基因很可能在 ...

我提供的假基因的CDS区。。。它和正基因的同源性高达96%，可是我研究它的功能就必须P它的CDS区呀，对吧？仁兄有什么好的建议吗？我是不是进入一个死胡同了呢？
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keepon
7楼2012-10-08 08:20:28
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review

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-10-07 14:40:43
楼主用什么作为模板的，是否可以肯定模板没有问题呢
另外，这段CDS序列是固定的话，那么楼主设计的引物其实也就固定了，不用加保护碱基，直接上游引物取原序列前20位左右，下游引物取互补序列后20位左右

序列是固定的。那取上游引物取原序列前20位左右？不是从第一个碱基开始吗  如原始序列：tatca........   ，加入从第二个碱基a开始   那会不会漏了前面tatc？那批出来还是全的吗    我是初学者  来学习的  请指教啊
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交流
8楼2012-10-25 17:15:47
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-28 17:46:35
引用回帖:
8楼: Originally posted by review at 2012-10-25 17:15:47
序列是固定的。那取上游引物取原序列前20位左右？不是从第一个碱基开始吗  如原始序列：tatca........   ，加入从第二个碱基a开始   那会不会漏了前面tatc？那批出来还是全的吗    我是初学者  来学习的  请指教啊...

如果楼主从第二个碱基a开始，那么意思是引物应该是atca...，请放心，是不是漏了前面楼主说的tatc的，因为楼主设计的引物包括了tatc中的atc。还有就是一般开放读码框开始都是ATG，起始密码子
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有时候，一句话，可以改变未来
9楼2012-10-28 12:25:28
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