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毕赤酵母电转化问题
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各位虫友大家好： 我用的酵母是毕赤酵母GS115，质粒是PIC3.5K和PIC9K，线性化酶是SacI 问题： 电转后涂MD板，每次都长得一片尸体装，旁边有单菌落也是非常的小，根本没办法挑起来继续往下做。所以我就干脆电转后涂G418为0.25mg/ml的YPD板，结果电转2天就会长出20个左右的单菌落，3-4天菌落就很大了，可以进行以后的实验。但我以后是做MD/MM筛选呢？还是继续扩大培养接种到高浓度的G418的板上啊？ 因为我看手册上说用SacI线性化的PIC3.5K和PIC9K就是Mut+型的，我还需要进一步鉴定吗？考虑到毕赤酵母的生长周期较长，我想偷下懒，因为之前没有人指导，我初做酵母，浪费不少时间，想把实验进展快一点，请问不鉴定可以吗？ 希望各位虫友多多指教 谢谢  |
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1.你电转的时间是多少呢，一般4-5毫秒最好 2、一片尸体状是长满板吗？？电转效率很高，建议最后一把加山梨醇1ml.涂布100微升就好了。 3.PIC3.5K这个载体应该是指PPICZαA这个载体吧，这个载体的抗性是博来霉素的，应该涂布YPD+博来霉素平板。 4、SacI线性化的PIC3.5K和PIC9K就是Mut+型的？？ 这个是不需要鉴定的，酵母表达手册里面说明白了。表型的影响可以参考华东理工的一片文章，说是表型对酵母发酵的影响，鉴定也可以，用通用引物进行基因组PCR，看有多少目的带。 5.MD再筛选是没有意义的，建议使用菌落PCR鉴定。 |
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