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adloves

新虫 (小有名气)

[求助] 大片段6kb-9kb DNA片段PCR窍门

最近在P大片段6kb-9kb DNA片段,老是P不出来,请问P长片段有哪些窍门?是不是买P长片段的Taq酶就行了, 求高手指点~~感激不尽~~
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杜钰~
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逆天打酱油

金虫 (正式写手)

好容易突变的吧
觉得可以分段克隆到载体上再用酶切酶连合并起来
全长这么长的真心没尝试过
2楼2012-09-22 09:39:50
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主可以试一下LA-PCR,传说中LA-PCR可以扩出35kb的带哦。
3楼2012-09-22 11:00:06
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adloves

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by jingdejun at 2012-09-22 11:00:06
楼主可以试一下LA-PCR,传说中LA-PCR可以扩出35kb的带哦。

好的,我试试看吧~~谢啦!
杜钰~
4楼2012-09-22 11:14:41
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-24 10:33:51
嗯....................
        同意3楼,建议选用TAKARA公司的LA-Taq来做,但是要注意,保真性只高出Taq3倍左右,如果头疼保真性的话,基于LA-PCR的原理,还是建议选择做融合PCR,两段融合,设计好引物还是很好做的。酶切连接个人觉得有些麻烦。
       个人看法 若有说错请高手指点
Let God do with it as He wills
5楼2012-09-22 11:46:32
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junminh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
长段不算太长了,直接P就OK了。
6楼2012-09-22 11:49:08
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adloves

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-22 11:46:32
嗯....................
        同意3楼,建议选用TAKARA公司的LA-Taq来做,但是要注意,保真性只高出Taq3倍左右,如果头疼保真性的话,基于LA-PCR的原理,还是建议选择做融合PCR,两段融合,设计好引物还是很好做 ...

好的,谢啦!
杜钰~
7楼2012-09-24 07:38:40
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adloves

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by junminh at 2012-09-22 11:49:08
长段不算太长了,直接P就OK了。

就是没P出来所以求指教的嘛,我在试试看常规PCR吧~谢啦!
杜钰~
8楼2012-09-24 07:39:54
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xfliu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-25 14:23:05
用LA-TAQ两步法P,我P过9Kb的,不难

但还是建议多片段P吧,那么长的片段,出现错配的可能性很高的
9楼2012-09-24 08:45:11
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junminh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

换酶,PRIMER STAR或者其它,有长片段TAQ。我们实验做都能P出来。
10楼2012-09-24 10:21:16
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