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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段6kb-9kb DNA片段PCR窍门
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adloves

新虫 (小有名气)

[求助] 大片段6kb-9kb DNA片段PCR窍门

最近在P大片段6kb-9kb DNA片段，老是P不出来，请问P长片段有哪些窍门？是不是买P长片段的Taq酶就行了， 求高手指点~~感激不尽~~
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杜钰~
1楼 2012-09-22 09:31:26
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逆天打酱油

金虫 (正式写手)
好容易突变的吧
觉得可以分段克隆到载体上再用酶切酶连合并起来
全长这么长的真心没尝试过
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2楼2012-09-22 09:39:50
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主可以试一下LA-PCR，传说中LA-PCR可以扩出35kb的带哦。
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3楼2012-09-22 11:00:06
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adloves

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jingdejun at 2012-09-22 11:00:06
楼主可以试一下LA-PCR，传说中LA-PCR可以扩出35kb的带哦。

好的，我试试看吧~~谢啦！
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杜钰~
4楼2012-09-22 11:14:41
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-24 10:33:51
嗯....................
        同意3楼，建议选用TAKARA公司的LA-Taq来做，但是要注意，保真性只高出Taq3倍左右，如果头疼保真性的话，基于LA-PCR的原理，还是建议选择做融合PCR，两段融合，设计好引物还是很好做的。酶切连接个人觉得有些麻烦。
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
5楼2012-09-22 11:46:32
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junminh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
长段不算太长了，直接P就OK了。
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6楼2012-09-22 11:49:08
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adloves

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-22 11:46:32
嗯....................
        同意3楼，建议选用TAKARA公司的LA-Taq来做，但是要注意，保真性只高出Taq3倍左右，如果头疼保真性的话，基于LA-PCR的原理，还是建议选择做融合PCR，两段融合，设计好引物还是很好做 ...

好的，谢啦！
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杜钰~
7楼2012-09-24 07:38:40
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adloves

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by junminh at 2012-09-22 11:49:08
长段不算太长了，直接P就OK了。

就是没P出来所以求指教的嘛，我在试试看常规PCR吧~谢啦！
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杜钰~
8楼2012-09-24 07:39:54
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xfliu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-25 14:23:05
用LA-TAQ两步法P，我P过9Kb的，不难

但还是建议多片段P吧，那么长的片段，出现错配的可能性很高的
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9楼2012-09-24 08:45:11
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junminh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

换酶，PRIMER STAR或者其它，有长片段TAQ。我们实验做都能P出来。
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10楼2012-09-24 10:21:16
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