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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒电泳问题
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒电泳问题

最近做酶切，遇到一个非常神奇的事情。 希望大家能够解释下，非常感谢！
1.双酶切后，质粒大小与理论符合；
2.原质粒没有酶切，但是却比酶切后的质粒跑得慢！！！
一般质粒提出来之后以超螺旋形态的居多，而且超螺旋在电泳中的迁移速度最快，为什么会跑在线性的之后呢？真神奇，几次都是同样的结果，是不是质粒有问题啊？我用宝生物、生工的试剂盒提取了之后都是这样，这是怎么回事呢？
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1楼 2012-09-20 10:51:07
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主能不能把质粒的情况说的具体点，是载体质粒？大小大概是多少？如果能附图就更好了
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有时候，一句话，可以改变未来
2楼2012-09-20 13:03:08
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-20 13:03:08
楼主能不能把质粒的情况说的具体点，是载体质粒？大小大概是多少？如果能附图就更好了

我的质粒是pET28a，5.3kb左右，用的marker是5000的，如图所示，marker旁边的是原质粒，其次是双酶切之后的质粒，结果很匪夷所思。。。请你帮忙分析看看。
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3楼2012-09-20 14:31:09
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-20 13:03:08
楼主能不能把质粒的情况说的具体点，是载体质粒？大小大概是多少？如果能附图就更好了

附图如下：

Administrator 2012-09-19 16hr 40min.jpg
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4楼2012-09-20 14:34:22
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
xuyan_1215: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-09-22 09:57:29
从楼主图上来看，原质粒的位置大概在7000左右的位置，但如果5300环状质粒跑的位置应该是在4300线性位置，所以无论如何这个都不是pET28a，很有可能是pET28a插入了较大的目的片段，楼主还需要自己回想下有没有拿错菌，提错质粒。还有，希望楼主用15Kb的Marker跑，可以看得清楚点，毕竟5.3kb已经超出了5000的范畴。
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有时候，一句话，可以改变未来
5楼2012-09-20 16:06:35
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确实不太正常，其实环形的质粒用线性的MARKER跑没多大可比性，你可以拿一个确定大小的，跟你的PET差不多的环形质粒，跑个对比，一般5000的环形质粒，出现的位置在4500下面一点.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
6楼2012-09-20 16:24:30
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尚慕寒

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuyan_1215: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-22 09:57:46
没切过的质粒跑胶条带大小参考意义不大，我曾经同时提两管相同的质粒，跑出来大小完全不同。你用双酶切之后，条带大小正常，而且没有插入片段的条带，所以我认为质粒没有问题，你可以再用其他酶单酶切跑胶看看。
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高山仰止，景行行止，虽不能至，心向往之。
7楼2012-09-20 17:00:12
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 尚慕寒 at 2012-09-20 17:00:12
没切过的质粒跑胶条带大小参考意义不大，我曾经同时提两管相同的质粒，跑出来大小完全不同。你用双酶切之后，条带大小正常，而且没有插入片段的条带，所以我认为质粒没有问题，你可以再用其他酶单酶切跑胶看看。

我也单酶切过，还是同样的结果，线性的跑在前面，这样就不知道是否正常，菌是师姐给的，我问了她说没有问题，到底是怎么了呢？
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8楼2012-09-20 18:48:44
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-20 16:06:35
从楼主图上来看，原质粒的位置大概在7000左右的位置，但如果5300环状质粒跑的位置应该是在4300线性位置，所以无论如何这个都不是pET28a，很有可能是pET28a插入了较大的目的片段，楼主还需要自己回想下有没有拿错菌， ...

我再确认一下吧，已经开始做连接了，如果这一步有问题，下面根本就不能成功。两个酶切位点之间就差了29bp，双酶切之后的条带是不是也不大正常啊，怎么离5000那么近，你看呢？
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9楼2012-09-20 18:54:29
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 18:54:29
我再确认一下吧，已经开始做连接了，如果这一步有问题，下面根本就不能成功。两个酶切位点之间就差了29bp，双酶切之后的条带是不是也不大正常啊，怎么离5000那么近，你看呢？...

双酶切后的条带从位置来看是正常的，虽然如楼主所说的距离5000位置较近，但5300本身离5000的位置就不远，有些时候由于配胶跟跑电泳的原因，也是有可能距离5000非常近的。
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有时候，一句话，可以改变未来
10楼2012-09-20 19:26:42
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