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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒电泳问题

最近做酶切,遇到一个非常神奇的事情。 希望大家能够解释下,非常感谢!
1.双酶切后,质粒大小与理论符合;
2.原质粒没有酶切,但是却比酶切后的质粒跑得慢!!!
一般质粒提出来之后以超螺旋形态的居多,而且超螺旋在电泳中的迁移速度最快,为什么会跑在线性的之后呢?真神奇,几次都是同样的结果,是不是质粒有问题啊?我用宝生物、生工的试剂盒提取了之后都是这样,这是怎么回事呢?
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主能不能把质粒的情况说的具体点,是载体质粒?大小大概是多少?如果能附图就更好了
有时候,一句话,可以改变未来
2楼2012-09-20 13:03:08
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-20 13:03:08
楼主能不能把质粒的情况说的具体点,是载体质粒?大小大概是多少?如果能附图就更好了

我的质粒是pET28a,5.3kb左右,用的marker是5000的,如图所示,marker旁边的是原质粒,其次是双酶切之后的质粒,结果很匪夷所思。。。请你帮忙分析看看。
3楼2012-09-20 14:31:09
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-20 13:03:08
楼主能不能把质粒的情况说的具体点,是载体质粒?大小大概是多少?如果能附图就更好了

附图如下:

Administrator 2012-09-19 16hr 40min.jpg

4楼2012-09-20 14:34:22
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
xuyan_1215: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-09-22 09:57:29
从楼主图上来看,原质粒的位置大概在7000左右的位置,但如果5300环状质粒跑的位置应该是在4300线性位置,所以无论如何这个都不是pET28a,很有可能是pET28a插入了较大的目的片段,楼主还需要自己回想下有没有拿错菌,提错质粒。还有,希望楼主用15Kb的Marker跑,可以看得清楚点,毕竟5.3kb已经超出了5000的范畴。
有时候,一句话,可以改变未来
5楼2012-09-20 16:06:35
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
确实不太正常,其实环形的质粒用线性的MARKER跑没多大可比性,你可以拿一个确定大小的,跟你的PET差不多的环形质粒,跑个对比,一般5000的环形质粒,出现的位置在4500下面一点.
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
6楼2012-09-20 16:24:30
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尚慕寒

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xuyan_1215: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-22 09:57:46
没切过的质粒跑胶条带大小参考意义不大,我曾经同时提两管相同的质粒,跑出来大小完全不同。你用双酶切之后,条带大小正常,而且没有插入片段的条带,所以我认为质粒没有问题,你可以再用其他酶单酶切跑胶看看。
高山仰止,景行行止,虽不能至,心向往之。
7楼2012-09-20 17:00:12
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 尚慕寒 at 2012-09-20 17:00:12
没切过的质粒跑胶条带大小参考意义不大,我曾经同时提两管相同的质粒,跑出来大小完全不同。你用双酶切之后,条带大小正常,而且没有插入片段的条带,所以我认为质粒没有问题,你可以再用其他酶单酶切跑胶看看。

我也单酶切过,还是同样的结果,线性的跑在前面,这样就不知道是否正常,菌是师姐给的,我问了她说没有问题,到底是怎么了呢?
8楼2012-09-20 18:48:44
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-20 16:06:35
从楼主图上来看,原质粒的位置大概在7000左右的位置,但如果5300环状质粒跑的位置应该是在4300线性位置,所以无论如何这个都不是pET28a,很有可能是pET28a插入了较大的目的片段,楼主还需要自己回想下有没有拿错菌, ...

我再确认一下吧,已经开始做连接了,如果这一步有问题,下面根本就不能成功。两个酶切位点之间就差了29bp,双酶切之后的条带是不是也不大正常啊,怎么离5000那么近,你看呢?
9楼2012-09-20 18:54:29
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 18:54:29
我再确认一下吧,已经开始做连接了,如果这一步有问题,下面根本就不能成功。两个酶切位点之间就差了29bp,双酶切之后的条带是不是也不大正常啊,怎么离5000那么近,你看呢?...

双酶切后的条带从位置来看是正常的,虽然如楼主所说的距离5000位置较近,但5300本身离5000的位置就不远,有些时候由于配胶跟跑电泳的原因,也是有可能距离5000非常近的。
有时候,一句话,可以改变未来
10楼2012-09-20 19:26:42
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