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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS－PAGE银染不显色！
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foxcl

铁虫 (正式写手)

[求助] SDS－PAGE银染不显色！

方法如下：
电泳后胶水洗3次，每次10s
　　　　　↓
加固定液约100mL，>３０min，至胶无色　[甲醇50ml，醋酸10ml，水40ml
　　　　　↓
水洗２min，再水洗30min
　　　　　↓
敏化处理30min　[共100ml，甲醇50ml，戊二醛10ml，水40ml]
　　　　　↓
水洗２*１０min
　　　　　↓
银染20min，避光染的　　[共100ml，甲醛40ul，AgNO3终浓度0.25%，两者现用现混合，AgNO3避光保存]
　　　　　↓
水洗２*１min（或迅速水洗２次，都做过）
　　　　　↓
加显色液   [碳酸钠终浓度2.5%,100ml液体中 37%甲醛20ul，现用现混合，预冷过的]
　　　　　↓
半小时过去了，没有显色。２小时过去了，还是没有显色。求助分析原因。

BTY：大家碳酸钠的溶液PH大概多少？我用PH试纸测了一下，竟然是4－5左右的酸性。神啊。
          AgNO3的浓度应该没有问题吧。0.25%应该够了吧。第一次现配的也没有显色成功。
          显色不成功的胶还能从敏化那步开始重新做一下吗？

[ Last edited by foxcl on 2012-9-12 at 23:51 ]
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1楼 2012-09-12 23:48:37
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foxcl

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ybs007 at 2012-09-13 07:12:30
你的步骤应该没什么问题，这种情况大多是试剂引起的。你可以配点染色液和显色液，然后各取一点儿混到一起看有反应没。我怀疑你的问题可能出在硝酸银或者碳酸钠上，一般来说，硝酸银只要不是明显变黑就可以用，而且硝 ...

我后来又试了一下，在试剂重配的情况下，又显色不成功，后来一气之下，直接在染色液中加了硫代硫酸钠颗粒，然后迅速的显色，但是显色不深。目前还在摸索中。奇怪。
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7楼2012-09-16 23:23:23
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ybs007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
foxcl: 金币+2, ★★★很有帮助, 什么叫“基准级的NaCO3”？ 2012-09-13 09:05:05
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-13 14:29:26
你的步骤应该没什么问题，这种情况大多是试剂引起的。你可以配点染色液和显色液，然后各取一点儿混到一起看有反应没。我怀疑你的问题可能出在硝酸银或者碳酸钠上，一般来说，硝酸银只要不是明显变黑就可以用，而且硝酸银即使有问题也不至于一点儿颜色不出，会呈黄褐色。这样看来，碳酸钠出问题的概率很大，碳酸钠作为一个很普通的试剂常被大家忽略，碳酸钠很容易吸潮，建议你换一下新的碳酸钠，强烈推荐基准级的碳酸钠。
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平生我自知
2楼2012-09-13 07:12:30
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+4, 鼓励应助 2012-09-13 14:29:40
水洗时间太久，即使染上去也让你洗没啦！没染之前水洗这么久DNA会散开的，步骤太繁琐啦！你照我下面的步骤做一下，要是再不出来把胶图我看看什么问题！严格按照步骤来哦！
固定：10%无水乙醇（100ml）+0.5%冰醋酸（乙酸）（5ml），轻轻晃动5min；
漂洗：dH2O快速漂洗1次，不超过10s；
染色：0.3%AgNO3（3g）溶液中染色5min；
漂洗：dH2O快速漂洗，时间不超过10s；
显影：3%NaOH（30g）+0.5%甲醛（5ml）显影,轻轻晃动至带纹出现；
漂洗：dH2O快速漂洗，不超过10s；
定影：固定液中定影5min；
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低调稳重务实内敛---------------残
3楼2012-09-13 09:14:27
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foxcl

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wu_shiyong at 2012-09-13 09:14:27
水洗时间太久，即使染上去也让你洗没啦！没染之前水洗这么久DNA会散开的，步骤太繁琐啦！你照我下面的步骤做一下，要是再不出来把胶图我看看什么问题！严格按照步骤来哦！
固定：10%无水乙醇（100ml）+0.5%冰醋酸（ ...

昨天晚上已经染色后迅速水洗的

PS：我做的是蛋白银染，染之前洗30分钟应该不会蛋白散开吧？
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4楼2012-09-13 09:19:38
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