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foxcl铁虫 (正式写手)
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[求助]
SDS－PAGE银染不显色！
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方法如下： 电泳后胶水洗3次，每次10s ↓ 加固定液约100mL，>３０min，至胶无色 [甲醇50ml，醋酸10ml，水40ml ↓ 水洗２min，再水洗30min ↓ 敏化处理30min [共100ml，甲醇50ml，戊二醛10ml，水40ml] ↓ 水洗２*１０min ↓ 银染20min，避光染的 [共100ml，甲醛40ul，AgNO3终浓度0.25%，两者现用现混合，AgNO3避光保存] ↓ 水洗２*１min（或迅速水洗２次，都做过） ↓ 加显色液 [碳酸钠终浓度2.5%,100ml液体中 37%甲醛20ul，现用现混合，预冷过的] ↓ 半小时过去了，没有显色。２小时过去了，还是没有显色。求助分析原因。 BTY：大家碳酸钠的溶液PH大概多少？我用PH试纸测了一下，竟然是4－5左右的酸性。神啊。 AgNO3的浓度应该没有问题吧。0.25%应该够了吧。第一次现配的也没有显色成功。 显色不成功的胶还能从敏化那步开始重新做一下吗？ [ Last edited by foxcl on 2012-9-12 at 23:51 ] |
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【答案】应助回帖
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水洗时间太久，即使染上去也让你洗没啦！没染之前水洗这么久DNA会散开的，步骤太繁琐啦！你照我下面的步骤做一下，要是再不出来把胶图我看看什么问题！严格按照步骤来哦！ 固定：10%无水乙醇（100ml）+0.5%冰醋酸（乙酸）（5ml），轻轻晃动5min； 漂洗：dH2O快速漂洗1次，不超过10s； 染色：0.3%AgNO3（3g）溶液中染色5min； 漂洗：dH2O快速漂洗，时间不超过10s； 显影：3%NaOH（30g）+0.5%甲醛（5ml）显影,轻轻晃动至带纹出现； 漂洗：dH2O快速漂洗，不超过10s； 定影：固定液中定影5min； |
3楼2012-09-13 09:14:27
【答案】应助回帖
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| 你的步骤应该没什么问题，这种情况大多是试剂引起的。你可以配点染色液和显色液，然后各取一点儿混到一起看有反应没。我怀疑你的问题可能出在硝酸银或者碳酸钠上，一般来说，硝酸银只要不是明显变黑就可以用，而且硝酸银即使有问题也不至于一点儿颜色不出，会呈黄褐色。这样看来，碳酸钠出问题的概率很大，碳酸钠作为一个很普通的试剂常被大家忽略，碳酸钠很容易吸潮，建议你换一下新的碳酸钠，强烈推荐基准级的碳酸钠。 |
2楼2012-09-13 07:12:30
foxcl
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