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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 欲检测重组蛋白能否被磷酸化
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tianmaxk

木虫 (正式写手)

[求助] 欲检测重组蛋白能否被磷酸化

如题，我想重组个含有磷酸化位点的蛋白，然后检测下这个蛋白能否被磷酸化；
如果可以的话有没有什么方法能够确定一下蛋白的磷酸化位点.
请大家多多指教、探讨！
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享受美丽人生
1楼 2012-08-23 14:22:10
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-24 13:44:51
SDS－PAGE 可以尝试diamond Q染色磷酸化蛋白质。

或用碱性磷酸化酶处理你的样品释放磷酸离子，用Malachite Green 测定是否有磷酸离子从蛋白质释放出来，如果有，说明你的蛋白质有磷酸化。但位点测定还是用质谱分析最好。
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tianmaxk
3楼2012-08-24 04:51:06
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-24 13:44:42
tianmaxk: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！追问一下，一般用什么酶对磷酸化位点进行磷酸化？磷酸化位点只有一个能否检测出来？ 2012-08-24 14:36:10
试用一下PhosTag SDSPAGE，如果运气好，磷酸化的蛋白质和未磷酸化的（用碱性磷酸化酶处理一下）同时跑胶，看看是否有明显差异。我检测过单个磷酸化位点的蛋白质，分离的很好，很容易就区别出来了。也有蛋白质无法分离的。

测定磷酸化位点，如果有条件可以用质谱分析，分离到磷酸化肽测序。如果上述PhosTag方法可行，突变最可能的磷酸化位点，检验是否点突变消除了磷酸化，这是一个苯方法。
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2楼2012-08-24 04:43:19
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tianmaxk

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by mitocam at 2012-08-24 04:51:06
SDS－PAGE 可以尝试diamond Q染色磷酸化蛋白质。

或用碱性磷酸化酶处理你的样品释放磷酸离子，用Malachite Green 测定是否有磷酸离子从蛋白质释放出来，如果有，说明你的蛋白质有磷酸化。但位点测定还是用质谱分 ...

谢谢回复！
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享受美丽人生
4楼2012-08-24 14:38:15
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by mitocam at 2012-08-24 04:43:19
试用一下PhosTag SDSPAGE，如果运气好，磷酸化的蛋白质和未磷酸化的（用碱性磷酸化酶处理一下）同时跑胶，看看是否有明显差异。我检测过单个磷酸化位点的蛋白质，分离的很好，很容易就区别出来了。也有蛋白质无法分 ...

用什么蛋白激酶，决定于你的磷酸化位点。如果是PKA，最好用PKA复合体，而不是PKA催化亚基，因为复合体稳定容易保存。

如果用质谱分析，只要带磷酸化位点的肽能否电离并被测序，磷酸化位点就可以被测定。不过测定磷酸化位点还是有点挑战性和需要运气。
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5楼2012-08-24 16:23:26
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